XIV. METODA PRO STANOVENÍ RŮSTU NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH – metoda C.14 podle přílohy směrnice Komise 2001/59/ES ze dne 6. srpna 2001, kterou se po dvacáté osmé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 2001/59/ES“)
DODATEK 1
DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY
| Druhy | Doporučený rozsah zkušební teploty (°C) | Fotoperioda (h) | Doporučené rozpětí počáteční hmotnosti ryb (g) | Doporučená přesnost měření | Velikost násady (g/l) | Hustota obsádky (l-1) | Krmivo | Délka zkoušky (d) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Doporučené druhy: Oncorhynchus mykiss pstruh duhový | 12,5-16,0 | 12-16 | 1-5 | na 100 mg | 1,2-2,0 | 4 | sušené krmivo pro plůdek lososovitých ryb | ≥ 28 |
| Jiné dobře popsané druhy: Danio rerio danio pruhované | 21-25 | 12-16 | 0,050-0,100 | na 1 mg | 0,2-1,0 | 5-10 | živé krmivo (Brachionus Artemia) | ≥ 28 |
| Oryzias latipes halančík japonský | 21-25 | 12-16 | 0,050-0,100 | na 1 mg | 0,2-1,0 | 5-20 | živé krmivo (Brachionus Artemia) | ≥ 28 |
DODATEK 2
NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY
| Látka | Koncentrace |
|---|---|
| Nerozpuštěné látky | < 20 mg/l |
| Celkový organický uhlík | < 2 mg/l |
| Nedisociovaný amoniak | < 1µg/l |
| Zbytkový chlor | < 10 µg/l |
| Celkové organofosforové pesticidy | < 50 ng/l |
| Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly | < 50 ng/l |
| Celkový organický chlor | < 25 ng/l |
DODATEK 3
LOGARITMICKÁ ŘADA KONCENTRACÍ VHODNÁ PRO ZKOUŠKU TOXICITY (9)
| Sloupec (počet koncentrací mezi 100 a 10, nebo mezi 10 a 1)(1) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 32 | 46 | 56 | 63 | 68 | 72 | 75 |
| 10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56 |
| 3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42 |
| 1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32 |
| 2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24 | |
| 1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18 | |
| 1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13 | ||
| 1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10 | ||
| 1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5 | |||
| 1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6 | |||
| 1,5 | 2,7 | 4,2 | ||||
| 1,0 | 1,9 | 3,2 | ||||
| 1,4 | 2,4 | |||||
| 1,0 | 1,8 | |||||
| 1,3 | ||||||
| 1,0 | ||||||
1 Ze sloupců může být zvolena řada pěti (nebo více) po sobě jdoucích koncentrací. Mezilehlé body pro koncentrace ve sloupci (x) jsou uvedeny ve sloupci (2x + 1). Uvedené hodnoty mohou být koncentracemi vyjádřenými v objemových nebo hmotnostních procentech (mg/l nebo µg/l). Hodnoty mohou být podle potřeby násobeny nebo děleny jakoukoli mocninou 10. Řada ve sloupci 1 by mohla být použita při značné nejistotě, pokud jde stupeň toxicity.
XIV.1 METODA
Metoda růstové zkoušky pro stanovení toxicity je replikou metody OECD TG 215 (2000).
XIV.1.1 ÚVOD
Zkouška je určena k posouzení účinků dlouhodobé expozice chemickým látkám na růst nedospělých ryb. Je založena na metodě pro posouzení účinků chemických látek na růst nedospělého pstruha duhového (Oncorynchus mykiss) při průtokových podmínkách, která byla vyvinuta v Evropské unii a testována v okružních testech (1, 3). Mohou být použity také jiné dobře popsané druhy. Byly například získány zkušenosti z růstových zkoušek s daniem pruhovaným (Danio rerio) (2, 4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8).
Viz také obecný úvod, část C.
XIV.1.2 DEFINICE
Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou u látky pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.
NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.
ECx: je pro tuto metodu koncentrace zkoušené látky, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu ryb ve srovnání s kontrolami.
Velikost násady: je živá hmotnost ryb v jednotce objemu vody.
Hustota obsádky: je počet ryb v jednotce objemu vody.
Individuální specifická rychlost růstu ryby: vyjadřuje rychlost růstu jedince vycházející z jeho výchozí hmotnosti.
Průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž: vyjadřuje střední rychlost růstu populace v nádrži při určité koncentraci.
Pseudospecifická rychlost růstu: vyjadřuje rychlost růstu jednotlivce vycházející ze střední počáteční hmotnosti populace v nádrži.
XIV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Nedospělé ryby v exponenciální fázi růstu se po zvážení umístí do zkušebních nádrží a vystaví se řadě subletálních koncentrací zkoušené látky nejlépe za průtokových podmínek, nebo, pokud možno za vhodných semistatických podmínek (statické podmínky s obnovením média). Zkouška trvá 28 dnů. Ryby se krmí denně. Přísun potravy se řídí počáteční hmotností ryb a může být po 14 dnech nově vypočten. Na konci zkoušky se ryby opět zváží. Účinky na rychlost růstu se analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu, tj. ECx (např. EC10, EC20 nebo EC30). Data mohou být popřípadě porovnána s hodnotami pro kontrolní skupiny s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC).
XIV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Výsledky zkoušky akutní toxicity (viz zkušební metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku již musí být předloženy. To znamená, že jsou známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a je k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.
Užitečnými informacemi jsou strukturní vzorec, čistota látky, její stálost ve vodě a na světle, pKa, Po/v a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz zkušební metoda C.4).
XIV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— mortalita v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %,
— nárůst střední hodnoty hmotnosti ryb v kontrolní skupině (skupinách) musí být dostatečný na to, aby umožnil rozeznat minimální významnou změnu rychlosti růstu. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového musí střední hmotnost ryb v kontrolních skupinách vzrůst alespoň o polovinu (tj. o 50 %) jejich počáteční hmotnosti za 28 dnů; např. počáteční hmotnost: 1 g/rybu (= 100 %), konečná hmotnost po 28 dnech: ≥ 1,5 g/rybu (≥ 150 %),
— koncentrace rozpuštěného kyslíku musí dosahovat alespoň 60 % hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,
— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi lišit o více než ± 1 °C a měla by být udržována v rozpětí 2 °C v rozsahu teplot stanovených pro zkušební druh (dodatek 1).
XIV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XIV.1.6.1 Přístroje a pomůcky
Normální laboratorní vybavení a zejména:
a) oxymetr a pH metr;
b) vybavení pro stanovení tvrdosti vody a alkality;
c) vhodné zařízení pro regulaci teploty a pro její pokud možno nepřetržité sledování;
d) nádrže z chemicky inertního materiálu o vhodném objemu vzhledem k doporučenému nasazování a obsádce (viz bod 1.8.5 a dodatek 1);
e) vhodné přesné váhy (tj. vážící s přesností na ± 0,5 %).
XIV.1.6.2 Voda
Jako zkušební voda může být použita jakákoli voda, v níž zkušební druh dlouhodobě přežívá a roste. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH vody by měla být v rozmezí 6,5 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ± 0,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO3). S cílem zajistit, aby ředicí voda neměla nadměrný vliv na výsledek zkoušky (například v důsledku tvorby komplexů zkušební látky), by měly být v určitých intervalech odebírány vzorky k analýze. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců). Některé chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody jsou uvedeny v dodatku 2.
XIV.1.6.3 Zkušební roztoky
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.
Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním nebo sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony.
V některých případech může být pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné použití rozpouštědel nebo dispergátorů (solubilizačních činidel). Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na růst ryb ani viditelné nepříznivé účinky na nedospělé ryby, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu.
Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být v průběhu zkoušky kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je přijatelná výměna vody 6 litrů na gram ryb za den (viz bod 1.8.2.2).
U semistatických zkoušek (s obnovením média) bude častost obnovování média záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat vodu denně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška.
XIV.1.6.4 Výběr druhů
Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) je doporučeným druhem pro tuto zkoušku, neboť u něj bylo v okružních testech získáno nejvíce zkušeností (1, 3). Mohou však být použity jiné dobře popsané druhy, může však být nutné zkušební postup upravit, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. Jsou například zkušenosti s daniem pruhovaným (Danio rerio) (4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). V takovém případě by měly být uvedeny v závěrečné zprávě důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.
XIV.1.6.5 Chov ryb
Testovací ryby by měly pocházet z jednoho chovu (nejlépe ze stejného tření), který se alespoň dva týdny před zkouškou udržuje v podmínkách kvality vody a osvětlení, které jsou podobné podmínkám použitým ve zkoušce. V průběhu chovu a v průběhu zkoušky by měly být krmeny množstvím potravy odpovídajícím minimálně 2 % tělesné hmotnosti za den a nejlépe 4 % tělesné hmotnosti za den.
Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
— mortality vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;
— mortality od 5 % do 10 % populace: aklimatizace dalších sedm dnů; je-li mortalita během následujících sedmi dnů vyšší než 5 %, vymění se celá obsádka,
— mortalita nižší než 5 % populace za sedm dnů: obsádka se přijme.
Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny u ryb žádné nemoci.
XIV.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
„Uspořádáním zkoušky“ se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet ryb v nádrži. Uspořádání by mělo být v ideálním případě zvoleno s ohledem na:
Požadováno je stanovení statistické významnosti, s jakou má být daná velikost změny (např. změny rychlosti růstu) rozeznána, nebo přesnost, s jakou má být odhadnuta hodnota ECx (např. x = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne méně než 10). Bez toho nelze stanovit přesný rozsah studie.
Je důležité vzít na vědomí, že uspořádání, které je optimální při použití jedné metody statistické analýzy (nejlépe využívá prostředky), není nezbytně optimální pro jinou metodu. Doporučené uspořádání pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspořádání pro analýzu regresí.
V mnoha případech se regresní analýze dává přednost před analýzou variance, a to z důvodů diskutovaných Stephanem a Rogersem (9). Není-li však nalezen vhodný regresní model (r2 < 0,9), měl by být stanoven poměr NOEC/LOEC.
a) cíl studie;
b) metodu statistické analýzy, která bude použita;
c) dostupnost a cenu prostředků pro experiment.
XIV.1.7.1 Uspořádání pro analýzu regresí
Pro uspořádání zkoušky, která má být analyzována regresí, jsou důležité tyto zřetele:
a) koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC10,20,30) a rozsah koncentrací, při nichž dochází ke sledovanému účinku. Přesnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace vyvolávajících účinek, bude nejlepší, bude-li koncentrace vyvolávající účinek ležet uprostřed rozsahu zkušebních koncentrací. Při výběru vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné předběžné orientační zkoušky.
b) aby mohl být vytvořen uspokojivý statistický model, měla by zkouška zahrnovat alespoň jednu kontrolní nádrž a pět dalších nádrží o různých koncentracích. Podle vhodnosti by při použití solubilizačního činidla měla být vedle zkušebních skupin nasazena jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubilizačního činidla použité při nejvyšší zkušební koncentraci (viz body 1.8.3 a 1.8.4);
c) může být použita vhodná geometrická nebo logaritmická řada koncentrací (10) (viz dodatek 3). Upřednostňuje se logaritmické stupňování koncentrací;
d) je-li k dispozici více než šest nádrží, měly by být další nádrže použity buď pro duplicitní stanovení, nebo by měly být použity pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenšily rozestupy mezi koncentracemi. Obě použití lze doporučit stejnou měrou.
XIV.1.7.2 Uspořádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou variance (ANOVA)
Pro každou koncentraci by měly být nejlépe k dispozici nádrže pro duplicitní stanovení, statistická analýza by měla být provedena pro každou jednotlivou nádrž (11). Bez duplicitních nádrží není možné zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, než jaká je důsledkem rozdílů mezi jednotlivými rybami. Zkušenosti ale ukazují (12), že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami). Relativně přijatelnou alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby.
Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2.
Provádí-li se zkouška s duplicitními nádržemi, měl by být počet duplicitních kontrolních nádrží, a tedy i počet ryb, dvojnásobkem počtu ryb pro každou zkoušenou koncentraci, který by měl být pro všechny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou-li naproti tomu duplicitní nádrže použity, měl by být v kontrolní skupině stejný počet ryb jako ve skupině pro každou zkušební koncentraci.
Je-li ANOVA založena na nádržích namísto jednotlivých rybách (což by znamenalo buď ryby jednotlivě označit nebo použít „pseudospecifickou“ rychlost růstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné počet nádrží dostatečně znásobit, aby bylo možné stanovit odchylku pro nádrže v rámci jednotlivé koncentrace. To znamená, že by měl být počet stupňů volnosti pro chybu v analýze variance alespoň 5 (11). Jsou-li duplicitně použity pouze kontroly, existuje nebezpečí, že bude variabilita chyby vychýlena, neboť může narůstat se střední hodnotou dotyčné rychlosti růstu. Vzhledem k tomu, že rychlost růstu s největší pravděpodobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability.
XIV.1.8 POSTUP
XIV.1.8.1 Výběr a vážení testovacích ryb
Je důležité minimalizovat rozdíly v hmotnostech ryb na začátku zkoušky. Vhodná rozpětí velikostí ryb různých druhů doporučených pro tuto zkoušku jsou uvedena v dodatku 1. Rozpětí individuálních hmotností na začátku zkoušky by mělo být pro celou násadu ryb použitých ve zkoušce nejlépe ± 10 % aritmetického průměru hmotností a v žádném případě by nemělo překročit 25 %. Doporučuje se zvážit před zkouškou menší vzorek ryb s cílem odhadnout střední hodnotu hmotnosti.
24 hodin před zahájením zkoušky se obsádka ryb přestane krmit. Poté se provede náhodný výběr ryb. Za použití běžného anestetika (např. vodný roztok trikainmethansulfonátu (MS 222) o koncentraci 100 mg/l neutralizovaný přídavkem dvou dílů hydrogenuhličitanu sodného na jeden díl MS 222) se ryby jednotlivě s přesností uvedenou v dodatku 1 zváží za účelem stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha). Ryby s hmotností v požadovaném rozsahu se náhodně rozdělí do nádrží. Zaznamená se celková živá hmotnost ryb v každé zkušební nádrži. Při manipulaci s rybami za použití anestetik (včetně osušení a zvážení) může u nedospělých ryb, a zejména u druhů o malé velikosti, dojít ke stresu a poranění. S nedospělými rybami se tedy musí manipulovat s nejvyšší opatrností, aby nedošlo u zkušebních ryb ke stresu a poranění.
Ryby se opět zváží po 28 dnech zkoušky (viz bod 1.8.6). Považuje-li se však za nezbytné nově vypočítat přísun potravy, mohou být ryby opět zváženy po 14 dnech zkoušky (viz bod 1.8.2.3). Ke stanovení změn velikosti ryb, na jejichž základě se upravuje přísun potravy, může být použita jiná metoda, např. fotografická metoda.
XIV.1.8.2 Podmínky expozice
XIV.1.8.2.1 Délka expozice
Zkouška trvá více než 28 dnů.
XIV.1.8.2.2 Velikost násady a hustota obsádky
Je důležité, aby velikost násady a hustota obsádky vyhovovaly použitému zkušebnímu druhu (viz dodatek 1). Je-li hustota obsádky příliš vysoká, dojde ke stísnění vedoucímu ke snížené rychlosti růstu a popřípadě k nemocem. Je-li příliš nízká, může vyvolat teritoriální chování, což by mohlo rovněž ovlivnit růst. V každém případě by měla být velikost násady tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je velikost násady 16 ryb o hmotnosti 3 – 5 g do objemu 40 litrů přijatelná. Doporučené obnovování vody během zkoušky je 6 litrů na gram ryb za den.
XIV.1.8.2.3 Krmení
Ryby by měly být krmeny dostatečným množstvím vhodného krmiva (dodatek 1), aby byla umožněna přijatelná rychlost růstu. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k růstu mikroorganismů a k zakalení vody. U pstruha duhového by mělo těmto požadavkům vyhovovat množství odpovídající 4 % jejich tělesné hmotnosti za den (3, 16, 17, 18). Denní množství může být rozděleno na dva stejné podíly a podáno rybám dvakrát za den s odstupem alespoň pěti hodin.
Množství se řídí počáteční hmotností ryb v jednotlivé zkušební nádrži. Ryby se opět zváží 14. den a množství se nově vypočte. 24 hodin před vážením se ryby přestanou krmit. Nespotřebovaná potrava a výkaly se ze zkušebních nádrží každý den odstraní důkladným odsátím ze dna každé nádrže.
XIV.1.8.2.4 Světlo a teplota
Fotoperioda a teplota vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatek 1).
XIV.1.8.3 Zkušební koncentrace
Obvykle je nutných pět koncentrací zkoušené látky, a to bez ohledu na uspořádání zkoušky (viz bod 1.7.2). Při volbě vhodných zkušebních koncentrací by měla pomoci předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií). Použije-li se méně než pět koncentrací, mělo by být uvedeno odůvodnění. Nejvyšší zkušební koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky ve vodě.
Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo, neměla by být jeho konečná koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná (viz bod 1.6.3). Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.
XIV.1.8.4 Kontrolní skupiny
Počet kontrolních skupin v ředicí vodě závisí na uspořádání zkoušky (viz body 1.7 až 1.7.2). Použije-li se solubilizační činidlo, měl by být nasazen stejný počet kontrolních skupin se solubilizačním činidlem jako s ředicí vodou.
XIV.1.8.5 Častost analytických stanovení a měření
Během zkoušky se v pravidelných intervalech (viz níže) stanovují koncentrace zkoušené látky
Při průtokových zkouškách se průtok zásobních roztoků toxické látky a ředicí vody kontroluje v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Očekávají-li se změny koncentrace zkoušené látky v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 – 120 %, viz body 1.6.2 a 1.6.3), doporučuje se, aby byly nejnižší a nejvyšší zkoušené koncentrace analyzovány na začátku zkoušky a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to stejně často jako u stabilních látek.
U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot, se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 nominální hodnoty, musí být všechny koncentrace analyzovány stejně často jako u stabilnějších látek.
Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky v roztoku uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených hodnotách.
Může být nezbytné vzorky filtrovat (např. přes filtr velikostí pórů 0,45 um) nebo odstředit. Doporučuje se odstřeďování. Filtrace je přípustná jen neadsorbuje-li se zkoušená látka na filtry.
V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost, alkalita a popřípadě solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u statických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody a alkalita se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.
XIV.1.8.6 Pozorování
Hmotnost: na konci každé zkoušky se musí ryby, které přežily, zvážit za účelem XIV.stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha), a to buď jako skupina pro každou zkušební nádrž, nebo jednotlivě. Vážení ryb jako skupin se upřednostňuje před vážením jednotlivých ryb, které vyžaduje, aby byly ryby jednotlivě označeny. V případě vážení jednotlivých ryb pro stanovení individuální specifické rychlosti růstu by neměla zvolená technika označení vyvolávat u ryb stres (alternativou ke značení ryb vymražením značky může být popřípadě použití barevného rybářského vlasce).
Ryby se v průběhu zkoušky vyšetřují denně a zaznamenávají se jakékoli odchylky (hemoragie, odbarvení) a neobvyklé chování. Každý úhyn se zaznamená a uhynulé ryby se co nejdříve odstraní. Uhynulé ryby se nenahrazují, neboť velikost násady a hustota obsádky by měly být dostatečné na to, aby nedošlo k ovlivnění růstu v důsledku změn počtu ryb. Bude však nutné upravit množství krmiva.
XIV.2 DATA A ZPRÁVY
XIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, v počtu ryb. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.
Rychlost růstu se nevypočítává pro zkušební nádrže, v nichž mortalita překročila 10 %. Velikost mortality se ale uvede pro všechny zkušební koncentrace.
Bez ohledu na použitou metodu je hlavním ukazatelem specifická rychlost růstu r od okamžiku t1 do t2. Může být definována několika způsoby v závislosti na tom, zda jsou či nejsou ryby individuálně značeny nebo zda se požaduje průměrná hodnota pro nádrž.
kde:
r1 = individuální specifická rychlost růstu ryby
r2 = průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž
r3 = „pseudospecifická“ rychlost růstu
w1, w2 = hmotnosti určité ryby v čase t1 a t2
loge w1 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na začátku vyšetřovacího intervalu
loge w2 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na konci vyšetřovacího intervalu
loge w1 = průměr logaritmů hodnot w1 pro ryby v nádrži na začátku vyšetřovacího intervalu
loge w2 = průměr logaritmů hodnot w2 pro ryby v nádrži na konci vyšetřovacího intervalu
t1, t2 = čas (ve dnech) začátku a konce vyšetřovacího intervalu
r1, r2, r3 mohou být vypočteny pro interval 0 – 28 dnů a popřípadě (bylo-li provedeno měření 14. den) pro intervaly 0 – 14 a 14 – 28 dnů.
XIV.2.1.1 Analýza výsledků regresí (modelování závislosti koncentrace – odezva)
Touto metodou se závislostí mezi specifickou rychlostí růstu a koncentrací proloží vhodná matematická funkce, a to umožní odhadnout „ECx“, tj. jakoukoli požadovanou hodnotu EC. U této metody není nutný výpočet r pro jednotlivou rybu (r1) a namísto toho se analýza založí na průměrné hodnotě r (r2) pro nádrž. Dává se přednost posledně uvedené metodě. Je také vhodnější při použití velmi malých druhů.
Průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (r2) se graficky vynesou proti koncentraci kvůli kontrole závislosti odezvy.
K vyjádření závislosti r2 na koncentraci se zvolí vhodný model; jeho volba musí být řádně zdůvodněna.
Liší-li se pro jednotlivé nádrže počty ryb, které přežily, prokládá se vážený model s cílem zohlednit různé velikosti skupin.
Metoda proložení modelu musí umožnit odhadnout například hodnotu EC20 a stanovit její rozptyl (buď směrodatnou odchylku nebo interval spolehlivosti). Graf proloženého modelu se vynese spolu s daty, aby byla zřejmá vhodnost použitého modelu (9, 19, 20, 21).
XIV.2.1.2 Analýza výsledků pro stanovení LOEC
Bylo-li ve zkoušce použito pro každou koncentraci více nádrží, může být odhad LOEC založen na analýze variance (ANOVA) průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (viz bod 2.1) následované vhodným srovnáním průměrné hodnoty r pro každou koncentraci s průměrnou hodnotou r pro kontrolní skupiny (např. Dunnettovým nebo Williamsovým testem (13, 14, 15, 22)), aby se zjistila nejmenší koncentrace, u níž je na úrovni pravděpodobnosti 0,05 rozdíl významný. Nejsou-li předpoklady pro použití parametrických metod splněny, kvůli jinému než normálnímu rozdělení (např. se použije Shapiro-Wilkův test) nebo kvůli heterogennímu rozptylu (Bartlettův test), měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylů nebo by měla být provedena vážená ANOVA.
Není-li pro každou koncentraci počet nádrží znásoben, nebude ANOVA u jednotlivé nádrže citlivá nebo bude nemožná. V takovém případě je přijatelným kompromisem založit ANOVA na „pseudospecifické“ rychlosti růstu r3 nebo na jednotlivých rybách.
Průměrná hodnota r3 pro každou koncentraci může být poté porovnána s průměrnou hodnotou r3 pro kontrolní skupiny. Hodnotu LOEC lze poté nalézt výše uvedeným způsobem. Je třeba vzít na vědomí, že tato metoda neumožňuje zohlednit variabilitu mezi nádržemi ve větší míře, než s jakou se počítá v důsledku variability mezi rybami, a ani před ní nechrání. Ukázalo se však (9), že variabilita mezi nádržemi byla ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami) velmi malá. Nejsou-li v analýze využity jednotlivé ryby, musí být ve zprávě uvedena metoda nalezení odlehlých hodnot a její použití musí být zdůvodněno.
XIV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Výsledky je třeba interpretovat opatrně, leží-li naměřené hodnoty koncentrací toxické látky v roztocích blízko meze stanovitelnosti analytické metody, nebo klesá-li u semistatických zkoušek koncentrace zkoušené látky od okamžiku přípravy roztoku do jeho obnovení.
XIV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XIV.2.3.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
— údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.
XIV.2.3.2 Testovací druh
— vědecký název, podle možnosti,
— kmen, velikost, původ, jakákoli příprava atd.,
XIV.2.3.3 Zkušební podmínky
— použitý zkušební postup (např. semistatický/s obnovením, průtokový, nasazování, hustota obsádky atd.),
— uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží, zkušební koncentrace a znásobení počtu nádrží, počet ryb v nádrži),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovování (je-li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
— nominální zkušební koncentrace, střední hodnota naměřených hodnot v jednotlivých nádržích, její směrodatná odchylka a metody jejich stanovení a důkazy toho, že naměřené hodnoty odpovídají koncentracím zkoušené látky v pravém roztoku,
— charakteristiky ředicí vody: pH, alkalinita, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě solnost zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,
— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,
— podrobné informace o krmení (např. druh krmiva (krmiv), původ, podávané množství a frekvence krmení).
XIV.2.3.4 Výsledky
— doklady o tom, že kontrolní skupiny vyhověly kriteriu přežití, a data o mortalitě pro každou zkušební koncentraci,
— použité metody statistické analýzy, statistiky založené na znásobeném počtu nádrží nebo na jednotlivých rybách, zpracování dat a zdůvodnění použitých metod,
— data ve formě tabulky o individuálních a středních hodnotách hmotností ryb v den 0, 14 (bylo-li prováděno vážení) a 28, hodnoty průměrných rychlostí růstu pro nádrž nebo popřípadě pseudospecifických rychlostí růstu pro intervaly 0 – 28 dnů nebo popřípadě 0 – 14 a 14 – 28 dnů,
— výsledky statistické analýzy (tj. regresní analýzy nebo ANOVA) nejlépe ve formě tabulky nebo v grafické formě a hodnota LOEC (p = 0,05) a NOEC nebo ECx, popřípadě se směrodatnými odchylkami,
— výskyt jakýchkoli neobvyklých reakcí ryb a viditelné účinky vyvolané zkoušenou látkou.
XIV.3 LITERATURA
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.
(2) Meyer, A., Bierman, C. H., Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
(3) Ashley S., Mallett M. J., Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
(4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855-1870.
(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N., Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157-164.
(6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japonsko.
(7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N., Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 28, 287-297.
(8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W., Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
(9) Stephan C. E., Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner, D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Filadelfie, 328-338.
(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 str.
(11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10.–12. prosinec 1991.
(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
(14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.
(15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc 27, 103-117.
(16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture, 120, 123-133.
(17) Quinton, J. C., Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33-41.
(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 str.
(19) Bruce, R. D., Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.
(20) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D., McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
(21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 str.
(22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc., 28, 510-531.