XIV.2 DATA A ZPRÁVY
XIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, v počtu ryb. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.
Rychlost růstu se nevypočítává pro zkušební nádrže, v nichž mortalita překročila 10 %. Velikost mortality se ale uvede pro všechny zkušební koncentrace.
Bez ohledu na použitou metodu je hlavním ukazatelem specifická rychlost růstu r od okamžiku t1 do t2. Může být definována několika způsoby v závislosti na tom, zda jsou či nejsou ryby individuálně značeny nebo zda se požaduje průměrná hodnota pro nádrž.
kde:
r1 = individuální specifická rychlost růstu ryby
r2 = průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž
r3 = „pseudospecifická“ rychlost růstu
w1, w2 = hmotnosti určité ryby v čase t1 a t2
loge w1 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na začátku vyšetřovacího intervalu
loge w2 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na konci vyšetřovacího intervalu
loge w1 = průměr logaritmů hodnot w1 pro ryby v nádrži na začátku vyšetřovacího intervalu
loge w2 = průměr logaritmů hodnot w2 pro ryby v nádrži na konci vyšetřovacího intervalu
t1, t2 = čas (ve dnech) začátku a konce vyšetřovacího intervalu
r1, r2, r3 mohou být vypočteny pro interval 0 – 28 dnů a popřípadě (bylo-li provedeno měření 14. den) pro intervaly 0 – 14 a 14 – 28 dnů.
XIV.2.1.1 Analýza výsledků regresí (modelování závislosti koncentrace – odezva)
Touto metodou se závislostí mezi specifickou rychlostí růstu a koncentrací proloží vhodná matematická funkce, a to umožní odhadnout „ECx“, tj. jakoukoli požadovanou hodnotu EC. U této metody není nutný výpočet r pro jednotlivou rybu (r1) a namísto toho se analýza založí na průměrné hodnotě r (r2) pro nádrž. Dává se přednost posledně uvedené metodě. Je také vhodnější při použití velmi malých druhů.
Průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (r2) se graficky vynesou proti koncentraci kvůli kontrole závislosti odezvy.
K vyjádření závislosti r2 na koncentraci se zvolí vhodný model; jeho volba musí být řádně zdůvodněna.
Liší-li se pro jednotlivé nádrže počty ryb, které přežily, prokládá se vážený model s cílem zohlednit různé velikosti skupin.
Metoda proložení modelu musí umožnit odhadnout například hodnotu EC20 a stanovit její rozptyl (buď směrodatnou odchylku nebo interval spolehlivosti). Graf proloženého modelu se vynese spolu s daty, aby byla zřejmá vhodnost použitého modelu (9, 19, 20, 21).
XIV.2.1.2 Analýza výsledků pro stanovení LOEC
Bylo-li ve zkoušce použito pro každou koncentraci více nádrží, může být odhad LOEC založen na analýze variance (ANOVA) průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (viz bod 2.1) následované vhodným srovnáním průměrné hodnoty r pro každou koncentraci s průměrnou hodnotou r pro kontrolní skupiny (např. Dunnettovým nebo Williamsovým testem (13, 14, 15, 22)), aby se zjistila nejmenší koncentrace, u níž je na úrovni pravděpodobnosti 0,05 rozdíl významný. Nejsou-li předpoklady pro použití parametrických metod splněny, kvůli jinému než normálnímu rozdělení (např. se použije Shapiro-Wilkův test) nebo kvůli heterogennímu rozptylu (Bartlettův test), měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylů nebo by měla být provedena vážená ANOVA.
Není-li pro každou koncentraci počet nádrží znásoben, nebude ANOVA u jednotlivé nádrže citlivá nebo bude nemožná. V takovém případě je přijatelným kompromisem založit ANOVA na „pseudospecifické“ rychlosti růstu r3 nebo na jednotlivých rybách.
Průměrná hodnota r3 pro každou koncentraci může být poté porovnána s průměrnou hodnotou r3 pro kontrolní skupiny. Hodnotu LOEC lze poté nalézt výše uvedeným způsobem. Je třeba vzít na vědomí, že tato metoda neumožňuje zohlednit variabilitu mezi nádržemi ve větší míře, než s jakou se počítá v důsledku variability mezi rybami, a ani před ní nechrání. Ukázalo se však (9), že variabilita mezi nádržemi byla ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami) velmi malá. Nejsou-li v analýze využity jednotlivé ryby, musí být ve zprávě uvedena metoda nalezení odlehlých hodnot a její použití musí být zdůvodněno.
XIV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Výsledky je třeba interpretovat opatrně, leží-li naměřené hodnoty koncentrací toxické látky v roztocích blízko meze stanovitelnosti analytické metody, nebo klesá-li u semistatických zkoušek koncentrace zkoušené látky od okamžiku přípravy roztoku do jeho obnovení.
XIV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XIV.2.3.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
— údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.
XIV.2.3.2 Testovací druh
— vědecký název, podle možnosti,
— kmen, velikost, původ, jakákoli příprava atd.,
XIV.2.3.3 Zkušební podmínky
— použitý zkušební postup (např. semistatický/s obnovením, průtokový, nasazování, hustota obsádky atd.),
— uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží, zkušební koncentrace a znásobení počtu nádrží, počet ryb v nádrži),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovování (je-li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
— nominální zkušební koncentrace, střední hodnota naměřených hodnot v jednotlivých nádržích, její směrodatná odchylka a metody jejich stanovení a důkazy toho, že naměřené hodnoty odpovídají koncentracím zkoušené látky v pravém roztoku,
— charakteristiky ředicí vody: pH, alkalinita, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě solnost zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,
— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,
— podrobné informace o krmení (např. druh krmiva (krmiv), původ, podávané množství a frekvence krmení).
XIV.2.3.4 Výsledky
— doklady o tom, že kontrolní skupiny vyhověly kriteriu přežití, a data o mortalitě pro každou zkušební koncentraci,
— použité metody statistické analýzy, statistiky založené na znásobeném počtu nádrží nebo na jednotlivých rybách, zpracování dat a zdůvodnění použitých metod,
— data ve formě tabulky o individuálních a středních hodnotách hmotností ryb v den 0, 14 (bylo-li prováděno vážení) a 28, hodnoty průměrných rychlostí růstu pro nádrž nebo popřípadě pseudospecifických rychlostí růstu pro intervaly 0 – 28 dnů nebo popřípadě 0 – 14 a 14 – 28 dnů,
— výsledky statistické analýzy (tj. regresní analýzy nebo ANOVA) nejlépe ve formě tabulky nebo v grafické formě a hodnota LOEC (p = 0,05) a NOEC nebo ECx, popřípadě se směrodatnými odchylkami,
— výskyt jakýchkoli neobvyklých reakcí ryb a viditelné účinky vyvolané zkoušenou látkou.