XVI. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.16 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XVI.1 METODA
Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 213 (1998).

XVI.1.1 ÚVOD
Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení orální akutní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.
Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní orální toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní orální toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků.
K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

XVI.1.2 DEFINICE
Akutní orální toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od orálního podání jedné dávky zkoušené látky.
Dávka: je množství požité zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje hmotností (µg) zkoušené látky na jeden testovací organismus (µg na včelu). Skutečnou dávku u každé včely nelze vypočítat, neboť se včely krmí kolektivně. Lze však odhadnout průměrnou dávku (celkové požité množství zkoušené látky dělené počtem včel v klícce).
LD₅₀ (střední letální dávka) orálně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po orálním podáním způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD₅₀ se vyjadřuje v µg zkoušenou látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.
Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, jeli zcela nepohyblivý.

XVI.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozptýlené do cukerného roztoku. Včely jsou poté krmeny stejným roztokem neobsahujícím zkoušenou látku. Mortalita se zaznamenává denně během alespoň 48 hodin a porovnává se s kontrolními hodnotami. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD₅₀ pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

XVI.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
— LD₅₀ pro referenční látku odpovídá předpokládané hodnotě.

XVI.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XVI.1.5.1 Včelstvo
Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

XVI.1.5.2 Podmínky chovu a krmení
Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. měla by poskytovat dostatek prostoru.
Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l^-1 (50% (m/V)). Po podání zkušební dávky se podává potrava podle libosti. Systém krmení by měl umožňovat zaznamenání příjmu potravy pro každou klícku (viz bod 1.6.3.1). Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

XVI.1.5.3 Příprava včel
Shromážděné včely se náhodně rozdělí do klícek, které se náhodně umístí v experimentální místnosti.
Před začátkem zkoušky mohou včely až 2 h hladovět. Doporučuje se, aby nebyla včelám před expozicí podávána potrava, aby byly na začátku zkoušky rovnocenné, pokud jde o obsah zažívacího ústrojí. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

XVI.1.5.4 Příprava dávek
Je-li zkoušená látka mísitelná s vodou, může být rozptýlena přímo v 50% cukerném roztoku. U technických přípravků a látek s nízkou rozpustností ve vodě mohou být použita vehikula, jakou jsou organická rozpouštědla, emulgátory nebo dispergátory s nízkou toxicitou pro včely (např. aceton, dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Koncentrace vehikula závisí na rozpustnosti zkoušené látky a měla by být stejná pro všechny zkoušené koncentrace. Obecně je přiměřená 1% koncentrace vehikula a neměla by být překračována.
Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. Použijí-li se k rozpuštění zkoušené látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a cukerný roztok s rozpouštědlem/nosičem v koncentraci použité v dávkách.

XVI.1.6 POSTUP

XVI.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny
Počet zkoušených dávek a jejich opakování by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD₅₀ na úrovni spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD₅₀. Ředicí faktor a počet koncentrací pro dávkování se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné koncentrace pro dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.
Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Nasadí se také zkušební skupiny pro použité rozpouštědlo nebo nosič (viz bod 1.5.4).

XVI.1.6.2 Referenční látka
V rámci zkušebních skupin se použije referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD₅₀. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po deseti včelách. Přednostní referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD₅₀, 24 h, orálně v rozmezí 0,10 – 0,35 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

XVI.1.6.3 Expozice

XVI.1.6.3.1 Podávání dávek
Každé zkušební skupině včel se podá 100 – 200 µl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné koncentraci. Větší objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, neboť v cukerném roztoku musí být použit větší podíl. Sleduje se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou. Po spotřebování potravy (obvykle do 3 – 4 h) se z klícky odebere krmicí zařízení a nahradí se krmicím zařízením obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté podává podle libosti. U některých sloučenin může vést odmítnutí potravy s vysokými koncentracemi k tomu, že je spotřebováno málo potravy nebo že se nespotřebuje žádná potrava. Po maximálně 6 h se nespotřebovaná potrava se zkoušenou látkou nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou (např. měřením objemu nebo zvážení nespotřebované stravy).

XVI.1.6.3.2 Délka zkoušky
Zkouška trvá 48 h od okamžiku, kdy byl zkušební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Vzroste-li mortalita během prvních 24 h o 10 %, zkouška se prodlouží na 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekročí 10 %.

XVI.1.6.4 Pozorování
Mortalita se zaznamená po 4 h od zahájení zkoušky a poté po 24 h a 48 h (rozumí se po podání dávky). Jeli nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.
Odhadne se množství spotřebované potravy. Porovnáním rychlostí spotřebování potravy se zkoušenou látkou a bez ní lze získat informaci o přijatelnosti potravy se zkoušenou látkou. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

XVI.1.6.5 Limitní zkouška
V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD₅₀ je vyšší než tato hodnota. Při ní se postupuje stejným způsobem, tj. nasadí se tři paralelní zkušební skupiny pro každou zkušební koncentraci, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spotřebované potravy s účinnou látkou a použije se referenční látka. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

XVI.2 DATA A ZPRÁVY

XVI.2.1 DATA
Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-odezva pro každý čas pozorování a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD₅₀) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu ve kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). Pokud nebyla potrava zcela spotřebována, stanoví se spotřebovaná dávka zkoušené látky na skupinu. LD₅₀ se vyjádří v µg zkoušené látky na včelu.

XVI.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XVI.2.2.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a relevantní fyzikálněchemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
— údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).

XVI.2.2.2 Testovací druh
— vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru včel, datum výběru,
— informace o včelstvech použitých pro výběr testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.

XVI.2.2.3 Zkušební podmínky
— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
— podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
— metody přípravy zásobních a zkušebních roztoků (jeli použito, uvede se rozpouštědlo a jeho koncentrace),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jeli použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
— uspořádání zkoušky, např. použité zkušební koncentrace a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou koncentraci a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
— datum zkoušky.

XVI.2.2.4 Výsledky
— výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,
— primární údaje: mortalita pro každou zkoušenou koncentraci v každém čase pozorování,
— graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky,
— hodnoty LD₅₀ s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování a to pro zkoušenou látku a pro referenční látku,
— statistické metody použité pro stanovení LD₅₀,
— mortalita v kontrolních skupinách,
— jiné pozorované nebo naměřené biologické účinky, např. neobvyklé chování včel (včetně odmítnutí zkušební dávky), rychlost spotřebování potravy v exponovaných a neexponovaných skupinách,
— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu a jiné důležité informace.

XVI.3 LITERATURA

(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. březen 1993.

(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Res. 22, str. 119 – 125.

(3) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharm. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.

(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.