XVI.1.6 POSTUP

XVI.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny
Počet zkoušených dávek a jejich opakování by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD₅₀ na úrovni spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD₅₀. Ředicí faktor a počet koncentrací pro dávkování se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné koncentrace pro dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.
Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Nasadí se také zkušební skupiny pro použité rozpouštědlo nebo nosič (viz bod 1.5.4).

XVI.1.6.2 Referenční látka
V rámci zkušebních skupin se použije referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD₅₀. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po deseti včelách. Přednostní referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD₅₀, 24 h, orálně v rozmezí 0,10 – 0,35 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

XVI.1.6.3 Expozice

XVI.1.6.3.1 Podávání dávek
Každé zkušební skupině včel se podá 100 – 200 µl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné koncentraci. Větší objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, neboť v cukerném roztoku musí být použit větší podíl. Sleduje se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou. Po spotřebování potravy (obvykle do 3 – 4 h) se z klícky odebere krmicí zařízení a nahradí se krmicím zařízením obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté podává podle libosti. U některých sloučenin může vést odmítnutí potravy s vysokými koncentracemi k tomu, že je spotřebováno málo potravy nebo že se nespotřebuje žádná potrava. Po maximálně 6 h se nespotřebovaná potrava se zkoušenou látkou nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou (např. měřením objemu nebo zvážení nespotřebované stravy).

XVI.1.6.3.2 Délka zkoušky
Zkouška trvá 48 h od okamžiku, kdy byl zkušební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Vzroste-li mortalita během prvních 24 h o 10 %, zkouška se prodlouží na 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekročí 10 %.

XVI.1.6.4 Pozorování
Mortalita se zaznamená po 4 h od zahájení zkoušky a poté po 24 h a 48 h (rozumí se po podání dávky). Jeli nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.
Odhadne se množství spotřebované potravy. Porovnáním rychlostí spotřebování potravy se zkoušenou látkou a bez ní lze získat informaci o přijatelnosti potravy se zkoušenou látkou. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

XVI.1.6.5 Limitní zkouška
V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD₅₀ je vyšší než tato hodnota. Při ní se postupuje stejným způsobem, tj. nasadí se tři paralelní zkušební skupiny pro každou zkušební koncentraci, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spotřebované potravy s účinnou látkou a použije se referenční látka. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.