III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS – metoda C.3 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
DODATEK 1
Příklad postupu kultivace řas
Obecné poznámky
Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxicity.
Měly by být použity vhodné metody k tomu, aby bylo zajištěno, že kultury řas nebudou infikovány bakteriemi (ISO 4833). Vhodné mohou být axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.
Všechny operace se provádějí za sterilních podmínek, aby nedošlo ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami. Kontaminované kultury se vyřadí.
Postupy při získání kultur řas
Příprava živných roztoků (média):
Médium lze připravit zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace v autoklávu může vést ke ztrátě NH₃.
Kmenová kultura:
Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravidelně přenášejí do čerstvého média, kde slouží jako výchozí testovací materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar. Poté se nejméně jednou za dva měsíce přenášejí do čerstvého média.
Kmenové kultury se pěstují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné medium (objem přibližně 100 ml). Jsou-li řasy kultivovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.
Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby byla výchozí koncentrace u rychle rostoucího druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.
Růstovou rychlost druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Je-li známa, lze z ní odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.
Předkultura:
Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování testovacích kultur. Předkultura se kultivuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit.
DODATEK 2
V normě ISO 8692 - Jakost vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum jsou uvedeny výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

	Střední hodnota (mg·l-1)	Rozpětí (mg·l-1)
ErC50 (0 - 72 h)	0,84	0,60 až 1,03
EbC50 (0 - 72 h)	0,53	0,20 až 0,75

III.1 METODA

III.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit účinky látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobými zkouškami (72 h) lze posoudit účinky na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití s několika druhy řas, přičemž musí být v protokolu o zkoušce uveden popis metody.
Použití metody je nejsnadnější v případě látek rozpustných ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně zůstávají ve vodě.
Metodu lze použít pro látky, které přímo neovlivňují měření růstu řas.
Je žádoucí mít před započetím zkoušky k dispozici co nejúplnější údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Hustota buněk: počet buněk na jeden mililitr.
Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.
Růstová rychlost: nárůst hustoty buněk za jednotku času.
EC₅₀: v této metodě jde o koncentraci zkušební látky, která má za následek 50% snížení růstu (E_bC₅₀) nebo růstové rychlosti (E_rC₅₀) vzhledem ke kontrole.
NOEC (no observed effect concentration): v této metodě jde o je nejvyšší zkoušenou koncentraci, při níž není pozorováno žádné významné snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l^-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg^-1).

III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Při použití referenční látky musí být výsledky uvedeny do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření, pokud se použijí. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních testech (viz (3) a doplněk 2).

III.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1, s cílem prokázat, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Exponenciálně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou po několik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkušební látky.
Zkušební roztoky se kultivují 72 h, během nichž se alespoň každých 24 h měří hustota buněk v každém roztoku. Stanoví se snížení růstu ve srovnání s kontrolní kulturou.

III.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na celý zkušební postup.
Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla za 3 dny zvýšit alespoň šestnáctkrát.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
U látek, které
i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
Je známo, že podstatná část zkušební látky může být během zkoušky zabudována do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií jakosti mělo brát v úvahu jak množství látky zabudované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, může být dodržení kritérií jakosti prokázáno zkouškou s nejvyšší koncentrací látky, ale bez řas, a měřením koncentrací v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.

III.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU

III.1.6.1 Činidla

III.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.
Zvolené zkušební koncentrace se připraví přidáním vhodného alikvotního podílu k předkulturám řas (viz doplněk 1).
Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou P_o/v nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).
Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontroly. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.

III.1.6.1.2 Zkušební médium
Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm^-1. Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.
Je doporučeno následující médium:
Podle následující tabulky se připraví čtyři zásobní roztoky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo v autoklávu a skladují se v temnu při 4 °C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.

Živina	Koncentrace v zásobním roztoku	Konečná koncentrace ve zkušebním roztoku
Zásobní roztok č. 1: makroživiny
NH4Cl	1,5	15 mg·l-1
MgCl2·6H2O	1,2	12 mg·l-1
CaCl2·2H2O	1,8	18 mg·l-1
MgSO4·7H2O	1,5	15 mg·l-1
KH2PO4	0,16	1,6 mg·l-1
Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA
FeCl3·6H2O	80	0,08 mg·l-1
Na2EDTA·2H2O	100	0,1 mg·l-1
Zásobní roztok č. 3: stopové prvky
H3BO3	185	0,18 mg·l-1
MnCl2·4H2O	415	0,415 mg·l-1
ZnCl2	3	3$\times$10-3 mg·l-1
CoCl2·6H2O	1,5	1,5$\times$10-3 mg·l-1
CuCl2·2H2O	0,01	1$\times$10-5 mg·l-1
Na2MoO4·2H2O	7	7$\times$10-3 mg·l-1
Zásobní roztok č. 4: NaHCO3
NaHCO3	50	50 mg·l-1

Po ustálení a po provzdušnění by mělo mít médium hodnotu pH přibližně 8.

III.1.6.2 Přístroje a pomůcky
— Běžné laboratorní vybavení.
— Kultivační baňky o vhodném objemu (např. Erlenmeyerovy baňky na 250 ml jsou vhodné v případě zkušebního roztoku o objemu 100 ml). Všechny zkušební baňky by měly být identické, pokud jde o materiál a rozměry.
— Kultivační zařízení: místnost nebo komora, v nichž lze udržovat teplotu 21 – 25 °C ± 2 °C a stálé rovnoměrné osvětlení v rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliže všechny řasy v kontrolních kulturách dosáhly doporučené růstové rychlosti, lze předpokládat, že podmínky pro jejich růst, včetně intenzity světla, jsou vyhovující.
U zkušebních roztoků s průměrnými koncentracemi se doporučuje použít světelnou intenzitu od 60 do 120 μE·m^-2·s^-1 (35 – 70·10¹⁸ fotonů m^-2·s^-1) při měření v rozsahu 400 – 700 nm vhodným detektorem. Při měření intenzity luxmetry je přijatelný rozsah odpovídající 6000 – 10 000 lx.
Této světelné intenzity lze dosáhnout umístěním čtyř až sedmi univerzálních bílých 30W zářivek (teplota chromatičnosti přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.
— Měření hustoty buněk by se mělo provádět přímým počítáním živých buněk, např. pod mikroskopem s počítacími komůrkami. Za předpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie,...).

III.1.6.3 Testovací organismy
Je doporučeno použít rychle rostoucí druhy zelených řas vhodné pro kultivaci a zkoušení. Dává se přednost následujícím druhům:
— Selenastrum capricornutum, např. ATCC 22662 nebo CCAP 278/4,
— Scenedesmus subspicatus, např. 86.81 SAG.
Poznámka:
ATCC = American Type Culture Collection (USA)
CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (VB)
SAG = Collection of algal culture (Göttingen, SRN)
Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.

III.1.6.4 Zkušební postup
Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, se určí na základě výsledků orientačních zkoušek.
Dva parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost), mohou poskytovat zcela rozdílné hodnoty snížení růstu; v orientační zkoušce by měly být použity oba parametry, aby mohlo zajištěno, že geometrická řada koncentrací umožní odhadnout jak E_bC₅₀, tak E_rC₅₀.
Počáteční hustota buněk
Doporučuje se, aby byla počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích přibližně 10⁴ buněk na ml. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být biomasa srovnatelná.
Koncentrace zkušební látky
Pro zkoušku se připraví geometrická řada nejméně pěti koncentrací lišících se od sebe vždy faktorem nepřekračujícím 2,2. Nejnižší zkoušená koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe by měla růst zcela zastavit.
Opakování a kontroly
Plán zkoušky by měl zahrnovat tři opakování s každou zkušební koncentrací. Dále se provedou tři kontroly bez zkušební látky, a je-li použita pomocná látka, též tři kontroly s touto látkou. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky s každou koncentrací.
Provedení zkoušky
Zkušební roztoky o požadované koncentraci zkušební látky a požadovaném množství inokula řas se připraví přidáním alikvotních podílů zásobního roztoku zkušební látky k vhodnému množství prekultury řas (viz doplněk 1).
Kultivační baňky se protřepou a umístí se do kultivačního zařízení. Buňky řas se udržují v suspensi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, aby se zlepšila výměna plynů a zmenšilo se kolísání pH ve zkušebních roztocích. Kultury se udržují při teplotě 21 – 25 °C udržované s přesností na ± 2 °C.
Hustota buněk v každé baňce se stanoví nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se měření hustoty buněk jiná metoda, než je jejich přímé počítání, použije se ke stanovení pozadí filtrované médium pro kultivaci řas obsahující odpovídající koncentraci zkušební chemické látky.
pH se měří na začátku zkoušky a po 72 h.
Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc než o 1,5.
Zkoušení těkavých látek
V současné době neexistuje obecně přijatý způsob zkoušení těkavých látek. Je-li o látce známo, že se snadno vypařuje, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným mrtvým objemem. Při plánování objemu horní části kultivačních baněk se musí zohlednit eventuální nedostatek CO₂. Byly navrženy varianty této metody (4).
Měl by být učiněn pokus stanovit množství zkušební látky, které v roztoku zůstalo; při interpretaci výsledků zkoušek s těkavými látkami v uzavřených systémech je doporučeno postupovat mimořádně opatrně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1 s cílem prokázat, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Je-li povaha zkušební látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg·l^-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede alespoň třikrát, se stejným počtem kontrol. V limitní zkoušce se stanoví oba parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost).
Zjistí-li se v limitní zkoušce pokles růstu biomasy nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolami o 25 % nebo více, provede se úplná zkouška.

III.2 DATA A HODNOCENÍ
Naměřené hustoty buněk ve zkušební kultuře a v kontrolách se spolu s koncentracemi zkušební látky a dobami měření shrnou do tabulky. Střední hodnota hustoty buněk pro každou zkušební koncentraci a pro kontroly se vynese proti času (0 – 72 h) a sestrojí se růstová křivka.
Vztah koncentrace/účinek se stanoví dvěma následujícími postupy. Některé látky mohou růst při nízkých koncentracích stimulovat. V úvahu by měla být vzata pouze data udávající potlačení růstu mezi 0 a 100 %.

III.2.1 POROVNÁNÍ PLOCH POD RŮSTOVÝMI KŘIVKAMI
Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou linií N = N₀ se vypočte podle následujícího vzorce:
$A=\frac{N_1-N_2}{2}.t_1+\frac{N_1+N_2-2N_0}{2}.t_2-t_1+\dots +\frac{N_{n-1}+N_n-2N_0}{2}.t_n-t_{n-1}$
kde
A = plocha,
N₀ = počet buněk v ml v čase t₀ (na počátku zkoušky),
N₁ = naměřený počet buněk v 1 ml v čase t₁,
N_n = naměřený počet buněk v 1 ml v čase t_n,
t₁ = doba prvního měření od počátku zkoušky,
t_n = doba n-tého měření od počátku zkoušky,
n = počet měření od počátku zkoušky.
Potlačení růstu vyjádřené v % (I_A) se pro každou koncentraci zkušební látky vypočte podle vzorce:
$I_A=\frac{A_c-A_t}{A_c}\times 100$
kde
A_c = plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N₀,
A_t = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N₀.
Hodnoty I_A se nanesou na semilogaritmický nebo na pravděpodobnostní semilogaritmický papír proti odpovídajícím koncentracím. Vynesou-li se body na pravděpodobnostní papír, proloží se body přímka, a to ručně nebo regresním výpočtem.
Hodnota EC₅₀ se odhadne odečtením z regresní přímky jako koncentrace odpovídající 50% snížení růstu (I_A ⁼ 50 %). Pro jednoznačné označení této hodnoty v rámci této metody výpočtu se doporučuje použít symbol E_bC_50. Je důležité, aby byla s hodnotou E_bC₅₀ uvedena příslušná expoziční doba, např. E_bC₅₀ (0 − 72 h).

III.2.2 POROVNÁNÍ RŮSTOVÝCH RYCHLOSTÍ
Průměrnou specifickou růstovou rychlost (μ) pro exponenciálně rostoucí kultury lze vypočítat jako:
$\mu =\frac{\ln N_n-\ln N_0}{t_n-t_0}$
kde t₀ je čas začátku zkoušky.
Průměrnou specifickou růstovou rychlost lze také odvodit ze sklonu regresní přímky v závislosti ln N na čase.
Snížení specifické růstové rychlosti vyjádřené v procentech pro každou koncentraci zkušební látky (I_μt) se vypočte podle vzorce:
$I_{\mu t}=\frac{{\mu }_{c-}{\mu }_t}{{\mu }_c}\times 100$
kde
μ_c = střední specifická růstová rychlost v kontrole,
μ_t = střední specifická růstová rychlost pro zkušební koncentraci t.
Snížení střední specifické růstové rychlosti v procentech při všech koncentracích zkušební látky ve srovnání s kontrolní hodnotou se vynese proti logaritmu koncentrace. Hodnotu EC₅₀ lze odečíst z výsledného grafu. Pro jednoznačné označení EC₅₀ odvozené touto metodou se doporučuje použít symbol E_rC₅₀. Musí být uvedeny okamžiky měření, např. vztahuje-li se hodnota k času 0 a k 72 h, označí se symbolem E_rC₅₀ (0 – 72 h):
Poznámka: Ve výrazu pro specifickou růstovou rychlost vystupují logaritmy, tzn. malé změny růstové rychlosti mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty E_bC a E_rC tedy nejsou číselně srovnatelné.

III.2.3 VÝPOČET NOEC
Hodnota koncentrace nezpůsobující žádné pozorovatelné účinky (NOEC) se stanoví vhodnou statistickou metodou pro srovnávání více vzorků (např. analýza rozptylu a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch pod růstovými křivkami A (viz bod 2.1) nebo specifických růstových rychlostí μ (viz bod 2.2).

III.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— zkušební látka: údaje o chemické identitě;
— testovací organismus: původ, laboratorní kultura, číslo kmene, metoda kultivace;
— zkušební podmínky:
— datum zahájení a ukončení zkoušky a délka zkoušení,
— teplota,
— složení média,
— kultivační zařízení,
— hodnoty pH roztoku na počátku a na konci zkoušky (je-li pozorováno kolísání pH o více než 1,5, uvede se vysvětlení),
— nosič a metoda použitá pro rozpouštění zkušební látky, koncentrace nosiče ve zkušebních roztocích,
— intenzita a kvalita světla,
— zkoušené koncentrace (naměřené nebo nominální);
— výsledky:
— koncentrace buněk v jednotlivých baňkách v každé době měření a metoda měření koncentrace buněk,
— průměrné hodnoty koncentrace buněk,
— růstové křivky,
— grafické znázornění vztahu koncentrace – účinek,
— hodnoty EC a metoda výpočtu,
— NOEC,
— další pozorované účinky.

III.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus“, In: Rudolph / Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986.

(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S. Galassi, M. Vighi. Chemosphere, 1981, 10, 1123-1126.