VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
VII.1.6.1 Reakční činidla
VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky
Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0.
K tomuto účelu se za použití chemikálií čistoty p.a. a destilované nebo deionizované vody připraví pufrační roztoky. Některé příklady pufračních roztoků jsou uvedeny v doplňku.
Použitý pufrační roztok může mít vliv na rychlost hydrolýzy; je-li tomu tak, je třeba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporučuje použít namísto fosforečnanových pufračních roztoků boritanové a acetátové pufrační roztoky.
Není-li známa hodnota pH pufračních roztoků při zkušební teplotě, lze ji stanovit s přesností na ±0,1 pH-metrem kalibrovaným při zvolené teplotě.
VII.1.6.1.2 Zkušební roztoky
Zkušební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by neměla překročit 0,01 mol·l-1 nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.
Použití organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě.
Množství tohoto rozpouštědla by mělo být menší než 1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy.
VII.1.6.2 Aparatura
Použijí se skleněné baňky se zabroušenými zátkami, pro něž není vhodné používat mazací tuk.
Pokud jsou chemická látka nebo pufrační roztok těkavé, nebo provádí-li se zkouška při zvýšené teplotě, upřednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavřené a s omezeným prostorem nad roztokem.
VII.1.6.3 Analytická metoda
Použitá metoda musí být specifická pro stanovení zkušební látky při zkušebních koncentracích a může být i kombinací vhodných analytických technik.
Použitá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně přesná a citlivá pro zjištění úbytku počáteční koncentrace o 10 %.
VII.1.6.4 Zkušební podmínky
Zkoušky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použití termostatované lázně nastavené na zvolenou teplotu s tolerancí ±0,5 °C. Teplota se udržuje a měří s přesností na ±0,1 °C. Vhodnými opatřeními je třeba zabránit fotolýze.
U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuštěný kyslík (např. 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem před přípravou roztoku).
VII.1.6.5 Zkušební postup
VII.1.6.5.1 Předběžná zkouška
U všech látek se provede předběžná zkouška při teplotě 50 ± 0,5°C pro tři hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je při 50 °C poločas (t½) menší než 2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 %. (Lze odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den, resp. delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu ukáže, že při 50 °C dojde při všech třech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkušební látky, nebo že po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 % zkušební látky, nejsou další experimenty nezbytné.
V ostatních případech a pro hodnoty pH, u nichž výše uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouška 1.
VII.1.6.5.2 Zkouška 1
Zkouška 1 se provede při jedné teplotě, nejlépe při 50 ± 0,5 °C, a pokud možno za sterilních podmínek při pH, pro něž se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek.
Zvolí se dostatečný počet vzorků, aby byl pokryt stupeň hydrolýzy 20 až 70 % a bylo tak možné ověřit, že jde při specifikovaném pH o reakci pseudoprvního řádu.
Pro každé pH, při němž se zkouška 1 provede, se stanoví řád reakce.
Odhad rychlostní konstanty při 25 °C:
Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkoušky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, či nikoliv.
Pokud nelze ze zkoušky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky 2.
Vyplývá-li s jistotou ze zkoušky 1, že jde o rekci pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím výsledků zkoušky 1, viz bod 3.2).
VII.1.6.5.3 Zkouška 2
Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
— buď při teplotě nižší než 40 °C,
— nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 2, se v přiměřených intervalech zvolí nejméně 6 bodů tak, že stupeň hydrolýzy je v oblasti 20 až 70 %.
Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měření dvakrát. Pokud se zkouška 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, provede se měření dvakrát nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se provede zkouška 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t½).
VII.1.6.5.4 Zkouška 3
Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
— buď při teplotě nižší než 40 °C,
— nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 3, se zvolí tři body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; vypočte se konstanta kpozorov. a poločas t½.