VII. METODA PRO STANOVENÍ ABIOTICKÉHO ROZKLADU – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH – metoda C.7 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
DODATEK
Pufrační roztoky

A. CLARK A LUBS
Hodnoty pH uvedené v následujících tabulkách byly vypočteny na základě měření potenciálu za použití Sörensenových standardních rovnic. Skutečné hodnoty pH jsou o 0,04 vyšší než hodnoty v tabulce.

Složení	pH
kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) při 20 °C
2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	3,8
kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	4,0
3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml	4,2
dihydrogenfosforečnan draselný (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml	6,8
29,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml	7,0
35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml	7,2
H3BO3 (0,1 mol·l-1) v KCl (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml	8,8
21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml	9,0
26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml	9,2

B. KOLTHOFF A VLEESHOUWER

Složení	pH
Monokalium-citrát(0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 18 °C (je třeba přidat malý krystalek thymolu, aby nevznikaly plísně)
2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	3,8
9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	4,0
16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml	4,2

C. SÖRENSEN
Borax (0,05 mol·l^-1) a HCl (0,1 mol·l^-1)

Složení		pH
ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	Walbum
			10 °C	40 °C	70 °C
8,0	2,0	8,91	8,96	8,77	8,59
8,5	1,5	9,01	9,06	8,86	8,67
9,0	1,0	9,09	9,14	8,94	8,74
9,5	0,5	9,17	9,22	9,01	8,80
10,0	0,0	9,24	9,30	9,08	8,86

Borax (0,05 mol·l^-1) a NaOH (0,1 mol·l^-1)

Složení		pH
ml boraxu	ml HCl	Sörensen 18 °C	Walbum
			10 °C	40 °C	70 °C
10,0	0,0	9,24	9,30	9,08	8,86
9,0	1,0	9,36	9,42	9,18	8,94
8,0	2,0	9,50	9,57	9,30	9,02
7,0	3,0	9,68	9,76	9,44	9,12

VII.1 METODA
Metoda je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

VII.1.1 ÚVOD
Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. Tato reakce má zvláštní význam u látek, které jsou málo biologicky rozložitelné; může ovlivnit stálost látky v životním prostředí.
Většina reakcí hydrolýzy probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, a poločasy jsou tedy nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků získaných s laboratorními koncentracemi na podmínky v životním prostředí.
Mimoto byly u několika typů chemických sloučenin publikovány příklady uspokojivé shody výsledků naměřených v čisté vodě a v přírodních vodách (2).
Při provádění této zkoušky je užitečné znát hodnotu tlaku par dané látky.
Metoda je použitelná pouze pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty mohou ovlivnit výsledky.
Chování látek při hydrolýze by mělo být zkoumáno při hodnotách pH, které se obvykle vyskytují v životním prostředí (pH 4 − 9).

VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou. Tuto reakci lze znázornit prostou výměnou skupiny X za skupinu OH:

$RX+HOH\to ROH+HX$

(1)

Rychlost, kterou klesá koncentrace látky RX, je dána vztahem:

$rychlost=k.H_{2}O.RX$

(2)

Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce ve velkém přebytku, označuje se obvykle tento typ reakce jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem:

$k_{\text{pozorov.}}=k.H_{2}O$

(3)

Tuto konstantu lze určit pro danou hodnotu pH a teplotu T z výrazu:

$k_{\text{pozorov.}}=\frac{\mathrm{2,303}}{t}\times log\frac{C_0}{C_t}$

(4)

kde
t = čas,
C₀ = koncentrace látky v čase 0,
C_t = koncentrace látky v čase t,
2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a dekadickým logaritmem.
Koncentrace se vyjádří v g·l^-1 nebo v mol·l^-1.
Konstanta k_pozorov. má rozměr [čas]^-1.
„Poločas“ t_½ je definován jako doba potřebná pro snížení koncentrace látky o 50 %,

$C_t=\text{1/2}·C_0$

(5)

Z rovnic (4) a (5) plyne, že

$t_{1/2}=\mathrm{0,693}/k_{\text{pozorov.}}$

(6)

VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
Jako referenční látky byly použity následující látky (1):
Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4-yl)fosforothioát (dimpylát, diazinon).

VII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Látka se rozpustí ve vodě v nízké koncentraci; pH a teplota se regulují.
Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.
Sestrojí se graf závislosti logaritmů koncentrací na čase, a je-li závislost lineární, lze zjistit rychlostní konstantu reakce prvního řádu ze směrnice přímky (viz bod 2).
Není-li možné stanovit rychlostní konstantu pro danou teplotu přímo, je obvykle možné odhadnout ji pomocí Arrheniovy rovnice, která udává teplotní závislost rychlostních konstant. Z průběhu lineární závislosti logaritmů rychlostních konstant, získaných při vhodných teplotách, na převrácené hodnotě absolutní teploty (K) lze extrapolací získat hodnotu rychlostní konstanty, kterou nebylo možné stanovit přímo.

VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
V odkazu (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.
Reprodukovatelnost závisí zejména na regulaci pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve speciálních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

VII.1.6.1 Reakční činidla

VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky
Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0.
K tomuto účelu se za použití chemikálií čistoty p.a. a destilované nebo deionizované vody připraví pufrační roztoky. Některé příklady pufračních roztoků jsou uvedeny v doplňku.
Použitý pufrační roztok může mít vliv na rychlost hydrolýzy; je-li tomu tak, je třeba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporučuje použít namísto fosforečnanových pufračních roztoků boritanové a acetátové pufrační roztoky.
Není-li známa hodnota pH pufračních roztoků při zkušební teplotě, lze ji stanovit s přesností na ±0,1 pH-metrem kalibrovaným při zvolené teplotě.

VII.1.6.1.2 Zkušební roztoky
Zkušební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by neměla překročit 0,01 mol·l^-1 nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.
Použití organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě.
Množství tohoto rozpouštědla by mělo být menší než 1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy.

VII.1.6.2 Aparatura
Použijí se skleněné baňky se zabroušenými zátkami, pro něž není vhodné používat mazací tuk.
Pokud jsou chemická látka nebo pufrační roztok těkavé, nebo provádí-li se zkouška při zvýšené teplotě, upřednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavřené a s omezeným prostorem nad roztokem.

VII.1.6.3 Analytická metoda
Použitá metoda musí být specifická pro stanovení zkušební látky při zkušebních koncentracích a může být i kombinací vhodných analytických technik.
Použitá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně přesná a citlivá pro zjištění úbytku počáteční koncentrace o 10 %.

VII.1.6.4 Zkušební podmínky
Zkoušky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použití termostatované lázně nastavené na zvolenou teplotu s tolerancí ±0,5 °C. Teplota se udržuje a měří s přesností na ±0,1 °C. Vhodnými opatřeními je třeba zabránit fotolýze.
U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuštěný kyslík (např. 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem před přípravou roztoku).

VII.1.6.5 Zkušební postup

VII.1.6.5.1 Předběžná zkouška
U všech látek se provede předběžná zkouška při teplotě 50 ± 0,5°C pro tři hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je při 50 °C poločas (t_½) menší než 2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 %. (Lze odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den, resp. delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu ukáže, že při 50 °C dojde při všech třech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkušební látky, nebo že po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 % zkušební látky, nejsou další experimenty nezbytné.
V ostatních případech a pro hodnoty pH, u nichž výše uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouška 1.

VII.1.6.5.2 Zkouška 1
Zkouška 1 se provede při jedné teplotě, nejlépe při 50 ± 0,5 °C, a pokud možno za sterilních podmínek při pH, pro něž se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek.
Zvolí se dostatečný počet vzorků, aby byl pokryt stupeň hydrolýzy 20 až 70 % a bylo tak možné ověřit, že jde při specifikovaném pH o reakci pseudoprvního řádu.
Pro každé pH, při němž se zkouška 1 provede, se stanoví řád reakce.
Odhad rychlostní konstanty při 25 °C:
Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkoušky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, či nikoliv.
Pokud nelze ze zkoušky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky 2.
Vyplývá-li s jistotou ze zkoušky 1, že jde o rekci pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím výsledků zkoušky 1, viz bod 3.2).

VII.1.6.5.3 Zkouška 2
Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
— buď při teplotě nižší než 40 °C,
— nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 2, se v přiměřených intervalech zvolí nejméně 6 bodů tak, že stupeň hydrolýzy je v oblasti 20 až 70 %.
Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měření dvakrát. Pokud se zkouška 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, provede se měření dvakrát nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se provede zkouška 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t_½).

VII.1.6.5.4 Zkouška 3
Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
— buď při teplotě nižší než 40 °C,
— nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 3, se zvolí tři body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; vypočte se konstanta k_pozorov. a poločas t_½.

VII.2 DATA
Jde-li o reakci pseudoprvního řádu, lze vypočítat hodnoty konstanty k_pozorov. pro každé pH a každou zkušební teplotu z grafu závislosti hodnot logaritmů koncentrací na čase pomocí rovnice:

$k_{\text{pozorov.}}=\text{– směrnice × 2,303}$

(7)

Dále je možné z rovnice (6) vypočítat t_½.
Podle potřeby se s použitím Arrheniovy rovnice stanoví k_{25 °C}.
Pokud chování neodpovídá reakci pseudoprvního řádu, viz bod 3.1.

VII.3 ZPRÁVA

VII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— specifikaci látky;
— všechny výsledky získané s referenčními látkami;
— podstatu a podrobnosti použité analytické metody;
— pro každou zkoušku: teplotu, pH, složení pufračního roztoku, tabulku se všemi údaji o koncentraci a čase;
— u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty k_pozorov. a t_½, včetně metody jejich výpočtu;
— u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, graf průběhu závislosti logaritmu koncentrace na čase;
— všechny informace a pozorování nezbytné pro interpretaci výsledků.

VII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkušebních látek za předpokladu, že pro homology chemické látky již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že lze důvodně očekávat, že aktivační energie zkušební látky je stejného řádu.

VII.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.

(2) W. Mabey, T. Mill.: Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions. J. Phys, Chem. Ref. Data, 1978, 7 (2), 383-415.