IV. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – metody C.4 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
IV.I.1 ÚVOD
Je popsáno šest metod, které umožňují screeningové posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:
Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a návody.
Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru látky, která má být zkoušena, se však může dávat přednost určité metodě.
a) Zkouška na úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC) (metoda C.4-A)
b) Modifikovaná screeningová zkouška OECD - na úbytek DOC (metoda C.4-B)
c) Zkouška na uvolňování oxidu uhličitého (CO2) (modifikovaná Sturmova zkouška) (metoda C.4-C)
d) Zkouška manometrickou respirometrií (metoda C.4-D)
e) Zkouška v uzavřených lahvičkách (metoda C.4-E)
f) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu – Japonsko) (metoda C.4-F)
IV.I.2 VÝBĚR VHODNÉ METODY
Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, tenzi par a o adsorpčních vlastnostech chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO2, DOC, TOC, CHSK (viz přílohy I a II) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.
Zkušební chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě je alespoň 100 mg·l-1, lze zkoušet všemi metodami za předpokladu, že netěkají a neadsorbují se. Pro látky špatně rozpustné ve vodě, které těkají nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Způsob, jakým je třeba zacházet s látkami špatně rozpustnými ve vodě a s látkami těkavými, je popsán v příloze III. Mírně těkavé látky je možno zkoušet metodou úbytku DOC, pokud je ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro zohlednění případné fyzikální ztráty.
Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod
| Zkouška | Analytická metoda | Vhodnost pro látky | ||
|---|---|---|---|---|
| špatně r ozpustné | těkavé | adsorbující se | ||
| na úbytek DOC | rozpuštěný organický uhlík | — | — | + /− |
| modif. zkouška OECD – na úbytek DOC | rozpuštěný organický uhlík | — | — | + /− |
| na uvolňování CO2 | respirometrie: uvolňování CO2 | + | — | + |
| manometrická respirometrie | manometrická respirometrie: spotřeba kyslíku | + | + /− | + |
| zkouška v uzavřených lahvičkách | respirometrie: rozpuštěný kyslík | + /− | + | + |
| MITI | respirometrie: spotřeba kyslíku | + | +/− | + |
Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkušebního materiálu.
Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkušební chemické látky pro bakterie (příloha IV); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.
IV.I.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Pro ověření postupu se souběžně se zkouškou a ve vlastní baňce zkoušejí referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.
Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), natrium-acetát, natrium-benzoát. Všechny tyto referenční chemické látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.
Byl podán návrh hledat referenční chemickou látku, která by byla snadno rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Navržen byl kalium-hydrogen-ftalát. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.
V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).
IV.I.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD
Roztok nebo suspense zkušební látky v minerálním prostředí se inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním světle. Množství DOC ve zkušebním roztoku pocházející z inokula se musí udržovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze zkušební látky co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě souběžné slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky, třebaže endogenní aktivita buněk v přítomnosti látky přesně neodpovídá aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se souběžně provádí zkouška s referenční látkou.
Obecně se rozklad sleduje stanovením parametrů jako DOC, tvorba CO2 nebo spotřeba kyslíku a měření se provádějí v dostatečně krátkých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se doplňkově k jinému parametru měří DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Lze rovněž použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkušební látky nebo kterou se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).
Zkouška obvykle trvá 28 dnů. Je však možné ukončit měření před uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje křivka biologického rozkladu plató po tři po sobě následující měření. Je také možné měření po 28 dnech prodloužit, jestliže z křivky vyplývá, že biologický rozklad začal, avšak 28. dne ještě nebylo ještě dosaženo plató.
IV.I.5 KRITÉRIA JAKOSTI
IV.I.5.1 Reprodukovatelnost
Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula se stanovení provádějí nejméně duplicitně.
Je obecně známo, že čím vyšší je koncentrace mikroorganismů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi vícenásobnými měřeními. Okružní testy rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.
IV.I.5.2 Platnost zkoušky
Zkouška se považuje za platnou, je-li na konci zkoušky nebo popřípadě na konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních výsledků vícenásobných měření rozkladu zkušební chemické látky v oblasti plató křivky menší než 20 % a dosáhl-li stupeň rozkladu referenční látky vyjádřený v procentech úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, měření se opakuje. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně skutečnost, že zkušební látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale znamenají, že k prokázání biologické rozložitelnosti jsou třeba další studie.
Jestliže ve zkoušce toxicity zahrnující jak zkušební látku, tak referenční chemickou látku došlo během 14 dnů k méně než 35% rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k méně než 25% rozkladu (stanoveného podle TSK nebo TCO2), lze zkušební chemické látky považovat za inhibující (viz také příloha IV). Série zkoušek by měla být opakována, pokud možno s nižší koncentrací zkušební chemické látky a/nebo s vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.
IV.I.6 OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA
Obecné podmínky pro zkoušky jsou shrnuty v tabulce 2. Přístroje a další experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.
Tabulka 2: Zkušební podmínky
| Zkouška | Zkouška na úbytek DOC | Zkouška na uvolňování CO2 | Manometrická respirometrie | Modif. screeningová zkouška OECD | Zkouška v uzavřených lahvičkách | Zkouška MITI (I) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Koncentrace zkušební látky | ||||||
| mg·l-1 | 100 | 2 - 10 | 100 | |||
| mg DOG/1 | 10-40 | 10 - 20 | 10 - 40 | |||
| mg TSK/l | 50 - 100 | 5 - 10 | ||||
| Koncentrace inokula (buňky/l, přibližně) | ≤ 30 mg/l SL nebo ≤ 100 ml odpadní vody/l (107-108) | 0,5 ml sekundární odpadní vody/l (105) | ≤ 5 ml odpadní vody/l (104-106) | 30 mg/l SL (107-108) | ||
| Koncentrace prvků v minerálním médiu (v mg·l-1) | ||||||
| P | 116 | 11,6 | 29 | |||
| N | 1,3 | 0,13 | 1,3 | |||
| Na | 86 | 8,6 | 17,2 | |||
| K | 122 | 12,2 | 36,5 | |||
| Mg | 2,2 | 2,2 | 6,6 | |||
| Ca | 9,9 | 9,9 | 29,7 | |||
| Fe | 0,05 – 0,1 | 0,05 - 0,1 | 0,15 | |||
| pH | 7,4 ± 0,2 | nejlépe 7,0 | ||||
| Teplota | 22 ± 2 °C | 25 ± 1 °C | ||||
| DOC = rozpuštěný organický uhlík, TSK = teoretická spotřeba kyslíku, SL = suspendované látky | ||||||
IV.I.6.1 Ředicí voda
Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek (např. ionty Cu2+). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkušebním materiálem. Vysoká čistota vody pro zkoušky je nezbytná pro to, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontaminace může pocházet z vlastních přítomných nečistot, z materiálu měniče iontů, z rozkladných látek z bakterií a řas. Pro každou sérii měření se použije pouze jedna šarže vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.
IV.I.6.2 Zásobní roztoky minerálních složek
Pro přípravu zkušebních roztoků se připraví zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu OECD, metodu s uvolňováním CO2, pro manometrickou respirometrii a pro metodu s uzavřenými lahvičkami.
Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkoušky.
Zásobní roztoky:
Za použití reakčních činidel čistoty p.a. se připraví následující zásobní roztoky:
| a) | Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4 | 8,50 g |
| Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4 | 21,75 g | |
| Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát, Na2HPO4·2H2O | 33,40 g | |
| Chlorid amonný, NH4Cl | 0,50 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.
| b) | Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2 | 27,50 g |
| nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl2·2H2O | 36,40 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
| c) | Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O | 22,50 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
| d) | Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O | 0,25 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.
IV.I.6.3 Zásobní roztoky chemických látek
Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g·l-1, rozpustí se například 1 – 10 g (podle potřeby) zkušební nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky připravují v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud jde o postup s méně rozpustnými chemickými látkami, viz příloha III; ve zkoušce MITI (metoda C.4-F) se nepoužívají ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.
IV.I.6.4 Inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce na úbytek DOC, na uvolňování CO2 a ve zkoušce manometrickou respirometrií, měl by být odebrán z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované screeningové zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je potřebné zředěnější inokulum bez vloček kalu a nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v oddílu věnovaném této zkoušce.
IV.I.6.4.1 Inokulum z aktivovaných kalů
Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Podle potřeby se filtrací přes jemné síto odstraní hrubé částice a kal se udržuje v aerobních podmínkách.
Jinou možností je usazení nebo odstředění (např. 10 min při 1 100 g) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 – 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a až do použití se provzdušňuje.
Kal by měl být odebrán z dobře fungující konvenční čistírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo předpokládá-li se, že kal obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstředí, voda nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.
Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsně před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných tuhých látek.
Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3 – 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 min zpracovává v mechanickém mísiči při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 min, popřípadě déle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml na litr minerálního média.
IV.I.6.4.2 Jiné zdroje inokula
Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 h usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a dekantovaná kapalina nebo filtrát se až do použití udržuje v aerobních podmínkách. Na litr média lze použít až 100 ml tohoto typu inokula.
Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní vody, a uchovává se až do použití v aerobních podmínkách. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odstředěním.
IV.I.6.5 Předběžná úprava inokulí
Inokula je možné předběžně upravit pro experimentální podmínky, ale nikoli předběžně adaptovat na zkušební látku. Předběžná úprava spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 – 7 dnů při zkušební teplotě. Předběžná úprava někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžná úprava inokula pro zkoušku MITI se nepovažuje za nutnou.
IV.I.6.6 Abiotické kontroly
V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkušební látky stanovením úbytku DOC, přijmu kyslíku nebo uvolňování oxidu uhličitého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací přes membránu (0,2 – 0,45 μm) nebo přidáním vhodné toxické látky v odpovídající koncentraci. Používá-li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkušební látky, měly by zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována.
IV.I.6.7 Počet nasazených baněk
Počet nasazených baněk v typické zkoušce je uveden v oddílech věnovaných jednotlivým zkouškám.
Mohou být použity tyto baňky:
Zkušební suspense: obsahující zkušební látku a inokulum
Slepá zkouška s inokulem: obsahující pouze inokulum
Kontrolní zkouška postupu: obsahující referenční látku a inokulum
Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkušební látku (viz I.6.6)
Kontrola adsorpce: obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo
Kontrola toxicity: obsahující zkušební látku, referenční látku a inokulum
Stanovení ve zkušební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být prováděny souběžně. Doporučuje se, aby stanovení v ostatních baňkách bylo prováděno rovněž souběžně.
To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo aby se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období rozkladu.
IV.I.7 DATA A HODNOCENÍ
Při výpočtu rozkladu v procentech Dt, se použijí střední hodnoty z měření parametru provedených duplicitně v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu s inokulem. Vzorce jsou uvedeny dále v oddílech pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a vyznačí se 10denní období rozkladu. Vypočte se a uvede úbytek v procentech dosažený na konci 10denního období rozkladu a hodnota pro plató křivky nebo popřípadě hodnota odpovídající konci zkoušky.
V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).
IV.I.7.1 Měření rozkladu prostřednictvím stanovení DOC
Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) by se měla hodnota rozkladu Dt v procentech v každém časovém okamžiku, ve kterém se odebral vzorek, vypočítat odděleně pro každou baňku obsahující zkušební látku, a to pomocí středních hodnot měření DOC provedených duplicitně. Vypočte se podle následující rovnice:
kde
Dt = rozklad v procentech v čase t,
C0 = střední počáteční koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku (v mg DOC na litr),
Ct = střední koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku v čase t (v mg DOC na litr),
Cbo = střední počáteční koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu (v mg DOC na litr),
Cbt = střední koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu v čase t (v mg DOC na litr).
Všechny koncentrace se stanoví experimentálně.
IV.I.7.2 Rozklad měřený specifickou analýzou
Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypočte se primární biologický rozklad z rovnice:
kde
Dt = rozklad v procentech v čase t, obvykle po 28 dnech,
Sa = zbylé množství zkušební látky v médiu s inokulem na konci zkoušky (mg),
Sb = zbylé množství zkušební látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla přidána pouze zkušební látka (mg).
IV.I.7.3 Abiotický rozklad
Použije-li se abiotická sterilní kontrola, vypočte se abiotický rozklad v procentech podle rovnice:
kde:
Cs(0) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den 0,
Cs(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den t.
IV.I.8 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— zkušební a referenční chemické látky a jejich čistota;
— zkušební podmínky;
— inokulum: charakter a místo (místa) odběru, koncentrace a jakákoli předběžná úprava;
— podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy;
— délka zkoušky a teplota;
— v případě špatně rozpustných zkušebních látek použitý způsob zpracování;
— použitá zkušební metoda; měly by být uvedeny vědecké důvody a vysvětlení pro veškeré změny postupu;
— přehled dat;
— veškeré pozorované projevy inhibice;
— jakýkoli pozorovaný abiotický rozklad;
— specifická analytická data o chemické látce, pokud existují;
— analytická data o meziproduktech, pokud existují;
— graf závislosti rozkladu v procentech na čase pro zkušební a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi iniciace, fázi rozkladu, 10denní období rozkladu a směrnici (příloha I). Vyhovuje-li zkouška kritériím jakosti, je možné v grafu použít střední hodnotu rozkladu v procentech v baňkách obsahujících zkušební látku;
— rozklad v procentech po 10denním období rozkladu, v oblasti plató a na konci zkoušky.