IV.I.6 OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA
Obecné podmínky pro zkoušky jsou shrnuty v tabulce 2. Přístroje a další experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.
Tabulka 2: Zkušební podmínky
| Zkouška | Zkouška na úbytek DOC | Zkouška na uvolňování CO2 | Manometrická respirometrie | Modif. screeningová zkouška OECD | Zkouška v uzavřených lahvičkách | Zkouška MITI (I) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Koncentrace zkušební látky | ||||||
| mg·l-1 | 100 | 2 - 10 | 100 | |||
| mg DOG/1 | 10-40 | 10 - 20 | 10 - 40 | |||
| mg TSK/l | 50 - 100 | 5 - 10 | ||||
| Koncentrace inokula (buňky/l, přibližně) | ≤ 30 mg/l SL nebo ≤ 100 ml odpadní vody/l (107-108) | 0,5 ml sekundární odpadní vody/l (105) | ≤ 5 ml odpadní vody/l (104-106) | 30 mg/l SL (107-108) | ||
| Koncentrace prvků v minerálním médiu (v mg·l-1) | ||||||
| P | 116 | 11,6 | 29 | |||
| N | 1,3 | 0,13 | 1,3 | |||
| Na | 86 | 8,6 | 17,2 | |||
| K | 122 | 12,2 | 36,5 | |||
| Mg | 2,2 | 2,2 | 6,6 | |||
| Ca | 9,9 | 9,9 | 29,7 | |||
| Fe | 0,05 – 0,1 | 0,05 - 0,1 | 0,15 | |||
| pH | 7,4 ± 0,2 | nejlépe 7,0 | ||||
| Teplota | 22 ± 2 °C | 25 ± 1 °C | ||||
| DOC = rozpuštěný organický uhlík, TSK = teoretická spotřeba kyslíku, SL = suspendované látky | ||||||
IV.I.6.1 Ředicí voda
Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek (např. ionty Cu2+). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkušebním materiálem. Vysoká čistota vody pro zkoušky je nezbytná pro to, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontaminace může pocházet z vlastních přítomných nečistot, z materiálu měniče iontů, z rozkladných látek z bakterií a řas. Pro každou sérii měření se použije pouze jedna šarže vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.
IV.I.6.2 Zásobní roztoky minerálních složek
Pro přípravu zkušebních roztoků se připraví zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu OECD, metodu s uvolňováním CO2, pro manometrickou respirometrii a pro metodu s uzavřenými lahvičkami.
Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkoušky.
Zásobní roztoky:
Za použití reakčních činidel čistoty p.a. se připraví následující zásobní roztoky:
| a) | Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4 | 8,50 g |
| Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4 | 21,75 g | |
| Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát, Na2HPO4·2H2O | 33,40 g | |
| Chlorid amonný, NH4Cl | 0,50 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.
| b) | Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2 | 27,50 g |
| nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl2·2H2O | 36,40 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
| c) | Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O | 22,50 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
| d) | Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O | 0,25 g |
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.
IV.I.6.3 Zásobní roztoky chemických látek
Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g·l-1, rozpustí se například 1 – 10 g (podle potřeby) zkušební nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky připravují v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud jde o postup s méně rozpustnými chemickými látkami, viz příloha III; ve zkoušce MITI (metoda C.4-F) se nepoužívají ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.
IV.I.6.4 Inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce na úbytek DOC, na uvolňování CO2 a ve zkoušce manometrickou respirometrií, měl by být odebrán z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované screeningové zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je potřebné zředěnější inokulum bez vloček kalu a nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v oddílu věnovaném této zkoušce.
IV.I.6.4.1 Inokulum z aktivovaných kalů
Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Podle potřeby se filtrací přes jemné síto odstraní hrubé částice a kal se udržuje v aerobních podmínkách.
Jinou možností je usazení nebo odstředění (např. 10 min při 1 100 g) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 – 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a až do použití se provzdušňuje.
Kal by měl být odebrán z dobře fungující konvenční čistírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo předpokládá-li se, že kal obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstředí, voda nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.
Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsně před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných tuhých látek.
Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3 – 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 min zpracovává v mechanickém mísiči při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 min, popřípadě déle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml na litr minerálního média.
IV.I.6.4.2 Jiné zdroje inokula
Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 h usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a dekantovaná kapalina nebo filtrát se až do použití udržuje v aerobních podmínkách. Na litr média lze použít až 100 ml tohoto typu inokula.
Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní vody, a uchovává se až do použití v aerobních podmínkách. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odstředěním.
IV.I.6.5 Předběžná úprava inokulí
Inokula je možné předběžně upravit pro experimentální podmínky, ale nikoli předběžně adaptovat na zkušební látku. Předběžná úprava spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 – 7 dnů při zkušební teplotě. Předběžná úprava někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžná úprava inokula pro zkoušku MITI se nepovažuje za nutnou.
IV.I.6.6 Abiotické kontroly
V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkušební látky stanovením úbytku DOC, přijmu kyslíku nebo uvolňování oxidu uhličitého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací přes membránu (0,2 – 0,45 μm) nebo přidáním vhodné toxické látky v odpovídající koncentraci. Používá-li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkušební látky, měly by zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována.
IV.I.6.7 Počet nasazených baněk
Počet nasazených baněk v typické zkoušce je uveden v oddílech věnovaných jednotlivým zkouškám.
Mohou být použity tyto baňky:
Zkušební suspense: obsahující zkušební látku a inokulum
Slepá zkouška s inokulem: obsahující pouze inokulum
Kontrolní zkouška postupu: obsahující referenční látku a inokulum
Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkušební látku (viz I.6.6)
Kontrola adsorpce: obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo
Kontrola toxicity: obsahující zkušební látku, referenční látku a inokulum
Stanovení ve zkušební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být prováděny souběžně. Doporučuje se, aby stanovení v ostatních baňkách bylo prováděno rovněž souběžně.
To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo aby se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období rozkladu.