bod IVE · 222/2004 Sb.

IVE. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH – metoda C.4-E podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVE.1. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Roztok zkušební látky v minerálním médiu, obvykle o koncentraci 2 až 5 mg·l^-1, se inokuluje malým množstvím mikroorganismů ze směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvičkách, v temnu a při konstantní teplotě. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím analýzy rozpuštěného kyslíku. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na souběžnou slepou zkoušku s inokulem se vyjádří jako TSK nebo CHSK.

IVE.2 POPIS METODY

IVE.2.1 Přístroje a pomůcky

a) Lahve pro analýzu BSK se skleněnými zátkami, např. na 250 − 300 ml.

b) Vodní lázeň nebo inkubátor pro udržování lahviček při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) v temnu.

c) Velké skleněné lahve na 2 − 5 l pro přípravu média a pro naplnění lahviček pro analýzu BSK.

d) Kyslíková elektroda a oxymetr nebo vybavení a činidla pro Winklerovu titrační metodu.

IVE.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.
Smísí se po 1 ml roztoků a) až d) a doplní se vodou na 1 litr.

IVE.2.3 Příprava inokula
Inokulum se obvykle získává z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Obvykle se použije jedna kapka (0,05 ml) až 5 ml filtrátu na litr média; k nalezení optimálního objemu dané odpadní vody může být nezbytné provést pokusy (viz I.6.4.2 a I.6.5).

IVE.2.4 Příprava lahviček
Minerální médium se alespoň 20 min silně provzdušňuje. Všechny série zkoušek se provedou s minerálním médiem ze stejné dávky. Obecně je médium připraveno k použití po 20 h stání při zkušební teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu; jeho obsah by měl být asi 9 mg·l^-1 při 20 °C. Všechny operace přenosu média nasyceného vzduchem a jeho plnění se provedou tak, aby nevznikaly bublinky, např. pomocí nasávaček.
Připravují se shodné skupiny lahviček pro analýzu BSK pro stanovení se zkušební látkou a referenční látkou v souběžných sériích experimentů. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů, tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu, např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů, bylo možné provést alespoň dvě měření spotřeby kyslíku. K tomu, aby bylo možné rozpoznat 10denní období rozkladu, může být potřeba více lahviček.
Velké lahve se přibližně do jedné třetiny naplní provzdušněným médiem. Poté se zvlášť do jednotlivých velkých lahví přidá dostatečný objem zásobního roztoku zkušební látky a referenční látky, a to obvykle tak, aby nebyla konečná koncentrace chemických látek větší než 10 mg·l^-1. Ke slepému pokusu v další velké lahvi se nepřidávají žádné chemické látky.
S cílem zajistit, aby aktivita inokula nebyla omezená, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách pro analýzu BSK klesnout pod 0,5 mg·l^-1. Toto omezuje koncentraci zkušební látky na 2 mg·l^-1. Pro látky, které se špatně rozkládají, a pro látky s nízkou hodnotou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg·l^-1. V některých případech se doporučuje provést souběžné série měření při dvou různých koncentracích zkušební látky, např. při 2 a 5 mg·l^-1. Obvykle se TSK počítá na základě tvorby amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace nebo kdy dochází k nitrifikaci, se TSK vypočte na základě tvorby dusičnanů (TSK_NO3, viz příloha II, bod 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, se provede korekce na změny analyticky stanovených koncentrací dusitanů a dusičnanů (viz příloha V).
Má-li být vyšetřena toxicita zkušební látky (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), je nezbytné nasadit další sérii lahviček.
Připraví se další velká láhev s provzdušněným minerálním médiem (naplněná asi do jedné třetiny objemu), do které se přidá zkušební a referenční chemická látka o konečné koncentraci obvykle stejné jako v případě ostatních velkých lahví.
Roztoky ve velkých lahvích se inokulují výstupem z druhého stupně čistírny odpadních vod (jedna kapka nebo 0,05 až 5 ml·l^-1) nebo z jiného zdroje inokula, jako je např. říční voda (viz I.6.4.2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným minerálním médiem za použití hadičky, která sahá na dno, aby se dosáhlo dostatečného promíchání.

IVE.2.5 Počet lahviček v typické zkoušce
V typické zkoušce se použijí následující lahvičky:
nejméně 10 lahviček se zkušební látkou a inokulem (zkušební suspense),
nejméně 10 lahviček pouze s inokulem (slepá zkouška s inokulem),
nejméně 10 lahviček s referenční látkou a inokulem (kontrolní zkouška postupu),
a podle potřeby 6 lahviček se zkoušenou látkou, referenční látkou a inokulem (kontrola toxicity). Pro rozpoznání 10denního období rozkladu je však potřebný dvojnásobný počet lahviček.

IVE.2.6 Provedení zkoušky
Všechny připravené roztoky se ihned po přípravě rozdělí do příslušné skupiny lahviček pro analýzu BSK, a to pomocí hadičky zavedené do spodní čtvrtiny velké lahve (nikoliv ke dnu) tak, aby se všechny lahvičky pro analýzu BSK zcela naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. V lahvičkách se Winklerovou metodou nebo pomocí oxymetru ihned stanoví obsah rozpuštěného kyslíku k počátku zkoušky (k času nula). Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného (prvním Winklerovým činidlem). Před provedením zbývajících kroků Winklerovy metody se pečlivě uzavřené lahvičky obsahující kyslík vázaný ve formě hydratovaného oxidu manganitého skladují v temnu nejdéle 24 h při teplotě 10 − 20 °C. Zbývající souběžně připravené lahvičky se uzavřou tak, aby v nich nezůstaly bublinky vzduchu, a inkubují se v temnu při 20 °C. Každá série musí být doprovázena úplnou sérií slepého pokusu s inokulovaným médiem. Ve všech sériích se během 28 dnů inkubace v pravidelných intervalech (nejméně jednou týdně) stanoví alespoň ve dvou lahvičkách obsah rozpuštěného kyslíku.
Týdenní vzorky umožní stanovení rozkladu v procentech ve 14denním období rozkladu, zatímco vzorky odebírané každé 3 − 4 dny umožní rozpoznat 10denní období rozkladu, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.
U látek obsahujících dusík se provede korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci. K tomuto účelu se stanoví koncentrace rozpuštěného kyslíku oxymetrem a poté se z lahvičky pro analýzu BSK odebere vzorek pro stanovení dusitanů a dusičnanů. Z přírůstku koncentrace dusitanů a dusičnanů se vypočte množství spotřebovaného kyslíku (viz příloha V).

IVE.3 DATA A ZPRÁVY

IVE.3.1 Zpracování výsledků
Nejprve se vypočte BSK, ke které došlo po každé časové periodě, a to odečtením spotřeby kyslíku (v mg O₂ na litr) ve slepém pokusu s inokulem od spotřeby, zkušební chemickou látkou. Takto korigovaná spotřeba se vydělí koncentrací zkušební látky (mg·l^-1) a získá se specifická BSK v mg kyslíku na mg zkušební látky. Biologická rozložitelnost v procentech se vypočte jako podíl specifické BSK a specifické TSK (vypočtené podle přílohy II, bodu 2) nebo CHSK (stanovené analyticky, viz příloha II, bod 3), tedy:
$B S K = \frac{{spotř. O}_{2} {zk. chem. látkou v mg - spotř. O}_{2} ve slep. pokusu v mg}{hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg} = {mg O}_{2} na mg zkušební chemické látky.$
$rozklad v % = \frac{BSK {mg O}_{2} na mg zkušeb. chem. látky}{TSK {mg O}_{2} na mg zkušeb. chem. látky} \times 100$
nebo
$rozklad v % = \frac{BSK {mg O}_{2} na mg zkušeb. chem. látky}{COD {mg O}_{2} na mg zkušeb. chem. látky} \times 100$
Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.
Pro látky, jež obsahují dusík, se použije odpovídající hodnota TSK (pro NH₄ nebo NO₃) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

IVE.3.2 Platnost výsledků
Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu s inokulem by neměla být po 28 dnech vyšší než 1,5 mg·l^-1. Vyšší hodnoty vyžadují přešetření experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku ve zkušebních lahvičkách by neměla nikdy klesnout pod 0,5 mg·l^-1. Takto nízké úrovně kyslíku jsou platné pouze tehdy, lze-li použitou metodou stanovení rozpuštěného kyslíku tak nízké úrovně přesně změřit.
Viz také I.5.2.

IVE.3.3 Zprávy
Viz I.8.

IVE.4 PŘEHLED DAT
Dále je uveden příklad přehledu dat:
ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg·l^-1
Počáteční koncentrace v lahvičce: mg·l^-1
TSK nebo CHSK: v mg O₂ na mg zkušební látky

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná úprava, pokud byla provedena:
Koncentrace v reakční směsi: mg·l^-1

5. STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU:
Metoda: Winklerova metoda / oxymetr
Analýzy lahviček

Doba kultivace (d)			Rozpuštěný kyslík (mg·l^-1)
Doba kultivace (d)			0	n₁	n₂
Slepá zkouška (bez chemické látky)	1	C₁
Slepá zkouška (bez chemické látky)	2	C₂
Průměr	$m_{b} = \frac{C_{1} + C_{2}}{2}$
Zkušební chemická látka	1	a₁
Zkušební chemická látka	2	a₂
Průměr	$m_{t} = \frac{a_{1} + a_{2}}{2}$

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)

Doba kultivace		0
i)	Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)
ii)	Změna koncentrace dusičnanů (mg N na litr)	—
iii)	Kyslíkový ekvivalent (mg·l^-1)	—
iv)	Koncentrace dusitanů (mg N na litr)
v)	Změna koncentrace dusitanů (mg N na litr)	—
vi)	Kyslíkový ekvivalent (mg·l^-1)	—
iii + vi)	Celkový kyslíkový ekvivalent (mg·l^-1)	—

7. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: ROZKLAD V PROCENTECH

	Úbytek po n dnech (mg·l^-1)
	n₁	n₂	n₃
LAHVIČKA 1: $m_{t 0} - m_{t x} - m_{b 0} - m_{b x}$
LAHVIČKA 2: $m_{t 0} - m_{t x} - m_{b 0} - m_{b x}$
LAHVIČKA 1:
${% D}_{1} = \frac{m_{t 0} - m_{t x} - m_{b 0} - m_{b x} \times 100}{konc. zkuš. chem. látky × TSK}$
LAHVIČKA 2:
$% D_{2} = \frac{m_{t 0} - m_{t x} - m_{b 0} - m_{b x} \times 100}{konc. zkuš. chem. látky × TSK}$
${průměr}^{*} % D = \frac{D_{1} - D_{2}}{2}$

^*Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.
m_t0 = hodnota pro zkušební lahvičku v čase 0
m_tx = hodnota pro zkušební lahvičku v čase x
m_b0 = hodnota pro slepý pokus v čase 0
m_bx = hodnota pro slepý pokus v čase x
Použijí se rovněž korekce na nitrifikaci z bodu iii + vi v oddílu 6.

8. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU
Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je $m_{b 0} - m_{b 28}$ v mg·l^-1. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg·l^-1.