IVF. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY MITI – metoda C.4-F podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVF.1 PODSTATA METODY
Měření spotřeby kyslíku v míchaném roztoku nebo suspensi zkušební chemické látky v minerálním médiu inokulovaném speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismů se provádí automaticky po dobu 28 dnů za tmy v uzavřeném respirometru při 25 ± 1 °C. Uvolňovaný oxid uhličitý se jímá v hydroxidu sodném. Biologická rozložitelnost se vyjádří jako spotřeba kyslíku (korigovaná na slepý pokus) vyjádřená v procentech teoretické spotřeby kyslíku (TSK). Primární biologická rozložitelnost vyjádřená v procentech se rovněž vypočte z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace, popřípadě z analýzy DOC.

IVF.2 POPIS METODY

IVF.2.1 Přístroje a pomůcky

a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr standardně vybavený 6 baňkami na 300 ml opatřenými uzávěry obsahujícími absorbent CO₂;

b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeň nastavená na 25 ± 1 °C;

c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);

d) analyzátor uhlíku (nepovinné).

IVF.2.2 Příprava minerálního média

a)	Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4	8,50
	Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4	21,75 g
	Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát, Na2HPO4·12H2O	44,60 g
	Chlorid amonný, NH4Cl	1,70 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,2.

b)	Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O	22,50 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

c)	Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2	27,50 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

d)	Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O	0,25 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Spojí se po 3 ml roztoků a), b), c), a d) a doplní se na 1 litr.

IVF.2.3 Příprava inokula
Odeberou se čerstvé vzorky nejméně z deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řeky, jezera a moře se odeberou litrové vzorky kalu, povrchových půd, vody atd., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyplavených látek a ustálení se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou.
Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na aktivaci kalu a kapalina se 23½ h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije přibližně jedna třetina celkového objemu supernatantu a k usazenému materiálu se přidá stejný objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a dihydrogenfosforečnanu draselného, a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována při 25 ± 2°C, pH má být 7 ± 1, kal se má dobře usazovat, provzdušňování musí být za všech okolností dostatečné, mají být přítomni prvoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé tři měsíce. Inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace, ale ne později než po čtyřech měsících. Proto se v pravidelných intervalech jednou za tři měsíce odebírají vzorky z 10 míst.
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtrovaného supernatantu čerstvě odebraného kalu pocházejícího z deseti zdrojů a směs se kultivuje podle výše uvedeného postupu. Kal se použije jako inokulum až 18 – 24 h po uvedeném zpracování.

IVF.2.4 Příprava baněk
Připraví se následujících 6 baněk:
Baňka č. 1: zkušební chemická látka v ředicí vodě, 100 mg·l^-1
Baňky č. 2, 3, 4: zkušební chemická látka v minerálním médiu, 100 mg·l^-1
Baňka č. 5: referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu, 100 mg·l^-1
Baňka č. 6: pouze minerální médium
Špatně rozpustné chemické látky se odváží nebo odměří, nebo se zpracují podle přílohy III, s výjimkou těch, u nichž nesmějí být použita rozpouštědla ani emulgátory. Do speciálních uzávěrů všech lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

IVF.2.5 Provedení zkoušky
Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspense), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby byla výsledná koncentrace kalu 30 mg·l^-1. Do lahve č. 1 se inokulum nepřidává, slouží jako abiotická kontrola. Zařízení se sestaví, přezkouší se na vzduchotěsnost, spustí se míchačka a v temnu se zahájí měření spotřeby kyslíku. Denně se kontroluje teplota, míchání, coulometrický zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenají se všechny změny barvy obsahu baněk. Spotřeba kyslíku pro 6 baněk se odečítá přímo, např. šestikanálovým zapisovačem, čímž se získá křivka BSK. Na konci kultivace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách a stanoví se zbytková koncentrace zkušební chemické látky a jejích produktů rozkladu a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také koncentrace DOC (postup podle přílohy II, bodu 4). Zvláštní pozornost je třeba věnovat těkavým látkám. Pokud se předpokládá nitrifikace, stanoví se podle možnosti koncentrace dusičnanů a dusitanů.

IVF.3 DATA A ZPRÁVY

IVF.3.1 Zpracování výsledků
Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu inokulem za stejnou dobu ve slepém pokusu) se podělí hmotností použité zkušební látky. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:
$BSK=\frac{{\text{spotř. O}}_2{\text{zk. chem. látkou v mg - spotř. O}}_2\text{ve slepé zkoušce v mg}}{\text{hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg}}={\text{mg O}}_2\text{na mg zkušební chemické látky.}$
Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:
$\text{biolog. rozklad v \% = \% TSK}=\frac{BSK{\text{mg O}}_2\text{na mg chem. látky}}{TSK{\text{mg O}}_2\text{na mg chem. látky}}\times 100.$
Pro směsi se TSK vypočte z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché sloučeniny. Použije se odpovídající hodnota TSK (TSK_NH4 nebo TSK_NO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).
Vypočte se primární biologický rozklad v procentech z úbytku specifické (výchozí) chemické látky (viz I.7.2):
$D_t=\frac{S_b-S_a}{S_b}\times 100$
Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta zkušební chemické látky v baňce č. 1, zaznamená se to a jako koncentrace zkušební látky (S_b) po 28 dnech se pro výpočet biologické rozložitelnosti dosadí tato koncentrace.
Stanovuje-li se koncentrace DOC (nepovinné), vypočte se konečná hodnota biologického rozkladu v procentech podle vztahu:
$D_t=1-\frac{C_t-C_{bt}}{C_0-C_{b0}}\times 100$
jak je uvedeno v bodě I.7.1. Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta DOC v baňce č. 1, použije se při výpočtu biologického rozkladu v procentech tato koncentrace DOC.
Všechny výsledky se zaznamenají do přehledu dat.

IVF.3.2 Platnost výsledků
Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O₂ na litr a neměla by být větší než 60 mg·l^-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l^-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.
Viz také I.5.2.
V případě, že rozklad anilinu vypočtený ze spotřeby kyslíku nepřekročí po 7 dnech 40 % a po 14 dnech 65 %, považuje se zkouška za neplatnou.

IVF.3.3 Zprávy
Viz I.8.

IVF.4 PŘEHLED DAT
Dále je uveden příklad přehledu dat:
ZKOUŠKA MITI (I)

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
Název:
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l^-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu, C₀: mg·l^-1
Objem reakční směsi, V: ml
TSK: mg O₂ na litr

4. INOKULUM
Místa odběru kalu:

1)...				6)...
2)...				7)...
3)...				8)...
4)...				9)...
5)...				10)...

Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci se syntetickými splašky mg·l^-1.
Objem aktivovaného kalu v litru konečného média = ... ml
Koncentrace kalu v konečném médiu = ... mg·l^-1

5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST
Typ použitého respirometru:

			Čas (dny)
			0	7	14	21	28
Spotřeba O2 (mg) zkušební látkou	a1
	a2
	a3
Spotřeba O2 (mg) ve slepé zkoušce	b
Korigovaná spotřeba O2(mg)	$a_1-b$ $a_2-b$ $a_3-b$
BSK na mg zkušební látky	$\frac{a-b}{C_{0}V}$	Baňka 1
		Baňka 2
		Baňka 3
Rozklad v % $\frac{BSK}{TSK}\times 100$		1
		2
		3
		Průměr*

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku.
^* Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.

6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)
Analyzátor uhlíku:

Baňka	DOC				úbytek DOC v %	Průměr
	Naměřená hodnota		Korigovaná hodnota
Voda + zkušební látka	a				—	—
Kal + zkušební látka	b1		$b_1-c$
Kal + zkušební látka	b2		$b_2-c$
Kal + zkušební látka	b3		$b_3-c$
Kontrolní slepá zkouška	c		—		—	—

$\text{odstraněný DOC v \%}=\frac{a-b-c}{a}\times 100$

7. DATA ZE SPECIFICKÉ CHEMICKÉ ANALÝZY

	Zbytkové množství zkušební chemické látky na konci zkoušky	Rozklad v %
Slepá zkouška s vodou	Sb
Inokulované médium	Sa1
	Sa2
	Sa3

$\text{rozklad v \%}=\frac{S_b-S_a}{S_b}\times 100$
Rozklad v % se vypočte pro baňky a1, a2, a3.

8. POZNÁMKY
Připojí se křivka závislosti BSK na čase, je-li k dispozici.

ZKRATKY A DEFINICE
DO: Rozpuštěný kyslík (dissolved oxygen) (mg·l^-1) je koncentrace kyslíku, který je rozpuštěn ve vodném vzorku.
BSK: Biochemická spotřeba kyslíku (biochemical oxygen demand, BOD) (g) je množství kyslíku, jež je v průběhu metabolizace zkušební látky spotřebováno mikroorganismy; vyjadřuje se také jako spotřeba kyslíku v gramech na gram zkušební látky. (Viz metoda C.5).
CHSK: Chemická spotřeba kyslíku (chemical oxygen demand, COD) (g) je množství kyslíku, jež je spotřebováno v průběhu oxidace zkušební látky horkým kyselým dichromanem; je měřítkem množství přítomných oxidovatelných látek; vyjadřuje se také v gramech kyslíku spotřebovaného na gram zkušební látky. (Viz metoda C.6).
DOC: Rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový organický uhlík, který je přítomný v roztoku nebo projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm nebo zůstane v supernatantu po odstřeďování po dobu 15 min při zrychlení 40 000 m·s^-2 (asi 4 000 g).
TSK: Teoretická spotřeba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; vypočte se z molekulového vzorce látky (viz příloha II, bod 2) a vyjadřuje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkušební látky.
TCO₂: Teoretický oxid uhličitý (theoretical carbon dioxide, ThCO₂) je množství oxidu uhličitého, které by mělo vzniknout ze známého nebo změřeného obsahu uhlíku ve zkušební látce za předpokladu její úplné mineralizace; vyjadřuje se v mg oxidu uhličitého uvolněného z 1 mg zkušební látky.
TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je součtem organického uhlíku v roztoku a v suspensi.
IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon).
TC: Celkový uhlík (total carbon) je součtem organického a anorganického uhlíku ve vzorku.
Primární biologický rozklad:
jsou změny chemické struktury látky způsobené biologickým působením, vedoucí ke ztrátě specifických vlastnosti látky.
Úplný biologický rozklad (aerobní):
je stupeň rozkladu látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buněčné hmoty (biomasy).
Snadno biologicky rozložitelná:
je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak přísné, že lze předpokládat, že se látky budou ve vodném prostředí za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.
Biologicky rozložitelná:
je klasifikace chemických látek, pro něž existuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.
Odstranitelnost:
je náklonnost látek k jejich odstranění při biologickém čištění odpadních vod, aniž by byl nepříznivě ovlivněn normální průběh čisticích pochodů. Látky snadno biologicky rozložitelné jsou obecně odstranitelné, avšak ne všechny rozložitelné látky jsou odstranitelné. Mohou zde působit také abiotické procesy.
Fáze iniciace:
je doba, ve zkoušce na úbytek rozpuštěného organického uhlíku, od inokulace do dosažení alespoň 10% biologického rozkladu. Fáze iniciace je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.
Doba rozkladu:
je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosažitelné úrovně rozkladu.
10denní období rozkladu:
je 10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10% rozkladu.

VÝPOČET A STANOVENÍ NĚKTERÝCH SOUHRNNÝCH PARAMETRŮ
V závislosti na zvolené zkušební metodě se vyžaduje určení některých souhrnných parametrů. V následujícím oddíle je popsán výpočet těchto hodnot. Využití těchto parametrů je popsáno u jednotlivých metod.
LITERATURA
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 12th ed., Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65.
— Wagner, R. von Wasser, 1976, vol 46, 139.
— DIN-Entwurf 38 409, Teil 41 – Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasserund Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrössen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13(1), 169.

1. Obsah uhlíku
Obsah uhlíku se počítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví analýzou prvků ve zkušební látce.

2. Teoretická spotřeba kyslíku (TSK)
Teoretickou spotřebu kyslíku (TSK) lze vypočítat ze znalosti elementárního složení nebo z výsledků analýzy prvků. Pro látku
C_cH_hCl_clN_nNa_naO_oP_pS_s
bez nitrifikace,
$*{TSK}_{NH4}=\frac{162c+\frac{1}{2}h-cl-3n+3s+\frac{5}{2}p+\frac{1}{2}na-o}{M}\text{v mg/mg}$
nebo s nitrifikací,
${TSK}_{NH4}=\frac{162c+\frac{1}{2}h-cl+\frac{5}{2}n+3s+\frac{5}{2}p+\frac{1}{2}na-o}{M}$

3. Chemická spotřeba kyslíku (CHSK)
Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) se stanoví metodou C.6.

4. Rozpuštěný organický uhlík (DOC)
Rozpuštěným organickým uhlíkem je podle definice organický uhlík přítomný ve vodném roztoku chemické látky nebo směsi, který projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm.
Odeberou se vzorky ze zkušebních nádob a ihned se filtrují pomocí filtračního zařízení s vhodným membránovým filtrem. Prvních 20 ml (toto množství může být při použití malých filtrů zmenšeno) se odstraní. 10 – 20 ml, nebo v případě nástřiku menší objem (objem závisí na množství potřebném pro analýzu), se uschová pro analýzu uhlíku. Koncentrace DOC se stanoví pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umožňuje přesné stanovení koncentrace uhlíku, která je menší nebo rovna 10 % počáteční koncentrace DOC použité ve zkoušce.
Zfiltrované vzorky, které není možné analyzovat ve stejný pracovní den, se uchovávají v ledničce 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.
Poznámky:
Membránové filtry jsou často impregnovány povrchově aktivními látkami za účelem jejich hydrofilizace. Filtr tedy může obsahovat až několik mg rozpustného organického uhlíku, který může ovlivnit stanovení biologické rozložitelnosti.
Povrchově aktivní látky a jiné rozpustné organické látky se z filtrů odstraňují vyvařením třikrát jednu hodinu v deionizované vodě. Filtry lze poté skladovat 1 týden ve vodě. Při použití filtračních patron pro jedno použití se musí u každé šarže ověřit, zda neobsahuje rozpustný organický uhlík.
V závislosti na typu membránového filtru může docházet k adsorpci zkušební látky na filtru. Doporučuje se ověřit, zda k adsorpci zkušební chemické látky na filtru nedochází.
Místo filtrace lze použít k rozlišení TOC od DOC odstřeďování při 40 000 m·s^-1 (4 000 g) po dobu 15 min. Tato metoda však není spolehlivá při počáteční koncentraci DOC < 10 mg·l^-1, protože buď nelze odstranit všechny bakterie, nebo se zpětně rozpouští uhlík, který je součástí bakteriální plasmy.

VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ŠPATNĚ ROZPUSTNÝCH LÁTEK
Při zkouškách biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek si zaslouží zvláštní pozornost následující aspekty.
Zatímco odběr vzorků homogenních kapalin je problémem jen zřídka, u tuhých látek se doporučuje provést homogenizaci vhodnými prostředky, aby v důsledku nehomogenity nedošlo k chybám. Zvláštní pozornost musí být věnována odběrům reprezentativních vzorků o několika miligramech ze směsí látek, které obsahují velké množství nečistot.
V průběhu zkoušek lze použít různé způsoby míchání. Je třeba věnovat pozornost tomu, aby míchání bylo přiměřené právě pro udržení látky v disperzi a nedocházelo k přehřívání, nadměrnému pěnění a nadměrným třecím silám.
Může se použít emulgátor vytvářející stabilní disperzi chemické látky. Nesmí být toxický pro bakterie a nesmí se biologicky rozkládat nebo pěnit za zkušebních podmínek.
Stejná kritéria jako pro emulgátory platí i pro rozpouštědla.
U tuhých zkušebních látek se nedoporučuje používat tuhé nosiče, mohou však být vhodné v případě olejovitých látek.
Použijí-li se pomocné látky, jako jsou emulgátory, rozpouštědla a nosiče, musí být proveden slepý pokus s pomocnou látkou.
Pro studium biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek lze použít kteroukoli ze tří respirometrických zkoušek (zkouška na úbytek CO₂, na BSK, zkouška MITI).
LITERATURA
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, 16, 833.
— Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI LÁTEK POTENCIÁLNĚ TOXICKÝCH PRO INOKULUM
Je-li chemická látka podrobena zkoušení snadné biologické rozložitelnosti a jeví se jako biologicky nerozložitelná, doporučuje se postupovat při požadavku rozlišit inhibiční působení od odolnosti látky vůči rozkladu následujícím způsobem (Reynolds et al., 1987).
Ve zkouškách toxicity i ve zkouškách biologické rozložitelnosti se použijí podobná nebo stejná inokula.
K posouzení toxicity chemických látek zkoušených ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti se doporučuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivovaného kalu (směrnice 88/302/EHS), stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci těchto metod.
Nemá-li dojít k inhibici z důvodu toxicity, měla by být koncentrace zkušební látky použitá ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti menší než 1/10 hodnoty EC₅₀ (nebo menší než EC₂₀) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC₅₀ > 300 mg·l^-1 pravděpodobně nemají při zkouškách snadné biologické rozložitelnosti toxické účinky.
Hodnoty EC₅₀ < 20 mg·l^-1 mohou při následném zkoušení působit potíže. Měly by být použity nízké koncentrace, což vyžaduje použít přísné a citlivé zkoušky v uzavřených lahvičkách nebo materiál značený ¹⁴C. Použití vyšších koncentrací zkušební látky může být popřípadě umožněno nasazením aklimatizovaného inokula. V tomto případě se však ztrácí specifické kritérium zkoušky snadné biologické rozložitelnosti.
LITERATURA
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, 16, 2259.

KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI
Chyby způsobené tím, že při stanovení spotřeby kyslíku ve zkouškách látek, které neobsahují dusík, není vzata v úvahu nitrifikace, nejsou významné (nejsou větší než 5 %), i když je oxidace amoniakálního dusíku ve zkušebních nádobách a ve slepém pokusu nepravidelná. U zkušebních látek obsahujících dusík může dojít ke značným chybám.
Dochází-li k nitrifikaci, avšak nikoli úplné, musí být spotřeba kyslíku reakční směsí korigována na množství kyslíku spotřebovaného na oxidaci amoniaku a amonných iontů na dusitany a dusičnany, jsou-li změny koncentrace dusitanů a dusičnanů během kultivace stanoveny pomocí následujících rovnic:
2 NH₄Cl + 3 O₂ = 2 HNO₂ + 2 HCl + 2 H₂O (1)
2 HNO₂ + O₂ = 2 HNO₃ (2)
Celkově:
2 NH₄Cl + 4 O₂ = 2 HNO₃ + 2 HCl + 2 H₂O (3)
Podle rovnice 1 je spotřeba kyslíku při oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH₄Cl na dusitan 96 g, tzn., že přepočítávací faktor je 3,43 (96/28). Stejně tak je podle rovnice 3 spotřeba kyslíku při oxidaci na dusičnan 128 g, tzn. přepočítávací faktor je 4,57 (128/28).
Protože popsané reakce následují po sobě, přičemž jsou realizovány odlišnými druhy bakterií, může koncentrace dusitanů stoupat i klesat; při poklesu roste odpovídajícím způsobem koncentrace dusičnanů. Spotřeba kyslíku při tvorbě dusičnanů se tedy vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusičnanů faktorem 4,57, zatímco spotřeba kyslíku při tvorbě dusitanů se vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusitanů faktorem 3,43, nebo při poklesu obsahu dusitanů se ztráty kyslíku vypočtou vynásobením poklesu koncentrace faktorem -3,43.
To znamená:
spotřeba O₂ při tvorbě dusičnanů = 4,57 × přírůstek koncentrace dusičnanů (4)
spotřeba O₂ při tvorbě dusitanů = 3,43 × přírůstek koncentrace dusitanů (5)
ztráta O₂ při úbytku dusitanů: = −3,43 × pokles koncentrace dusitanů (6)
Tedy
spotřeba O₂ při nitrifikaci = ± 3,43 × změna koncentrace dusitanů + 4,57 × změna koncentrace dusičnanů (7)
a proto
spotřeba O₂ v důsledku oxidace C = celková pozorovaná spotřeba – spotřeba v důsledku nitrifikace (8)
Jinými slovy, pokud se stanoví pouze celkový oxidovaný N, je možno za spotřebu kyslíku v důsledku nitrifikace považovat v prvém přiblížení hodnotu 4,57 x přírůstek oxidovaného dusíku.
Korigovaná hodnota spotřeby kyslíku v důsledku oxidace C se potom porovnává s TSK NH₃ vypočítanou podle přílohy II.