IVF.2 POPIS METODY

IVF.2.1 Přístroje a pomůcky

a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr standardně vybavený 6 baňkami na 300 ml opatřenými uzávěry obsahujícími absorbent CO₂;

b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeň nastavená na 25 ± 1 °C;

c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);

d) analyzátor uhlíku (nepovinné).

IVF.2.2 Příprava minerálního média

a)	Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4	8,50
	Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4	21,75 g
	Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát, Na2HPO4·12H2O	44,60 g
	Chlorid amonný, NH4Cl	1,70 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,2.

b)	Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O	22,50 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

c)	Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2	27,50 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

d)	Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O	0,25 g
	Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Spojí se po 3 ml roztoků a), b), c), a d) a doplní se na 1 litr.

IVF.2.3 Příprava inokula
Odeberou se čerstvé vzorky nejméně z deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řeky, jezera a moře se odeberou litrové vzorky kalu, povrchových půd, vody atd., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyplavených látek a ustálení se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou.
Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na aktivaci kalu a kapalina se 23½ h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije přibližně jedna třetina celkového objemu supernatantu a k usazenému materiálu se přidá stejný objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a dihydrogenfosforečnanu draselného, a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována při 25 ± 2°C, pH má být 7 ± 1, kal se má dobře usazovat, provzdušňování musí být za všech okolností dostatečné, mají být přítomni prvoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé tři měsíce. Inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace, ale ne později než po čtyřech měsících. Proto se v pravidelných intervalech jednou za tři měsíce odebírají vzorky z 10 míst.
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtrovaného supernatantu čerstvě odebraného kalu pocházejícího z deseti zdrojů a směs se kultivuje podle výše uvedeného postupu. Kal se použije jako inokulum až 18 – 24 h po uvedeném zpracování.

IVF.2.4 Příprava baněk
Připraví se následujících 6 baněk:
Baňka č. 1: zkušební chemická látka v ředicí vodě, 100 mg·l^-1
Baňky č. 2, 3, 4: zkušební chemická látka v minerálním médiu, 100 mg·l^-1
Baňka č. 5: referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu, 100 mg·l^-1
Baňka č. 6: pouze minerální médium
Špatně rozpustné chemické látky se odváží nebo odměří, nebo se zpracují podle přílohy III, s výjimkou těch, u nichž nesmějí být použita rozpouštědla ani emulgátory. Do speciálních uzávěrů všech lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

IVF.2.5 Provedení zkoušky
Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspense), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby byla výsledná koncentrace kalu 30 mg·l^-1. Do lahve č. 1 se inokulum nepřidává, slouží jako abiotická kontrola. Zařízení se sestaví, přezkouší se na vzduchotěsnost, spustí se míchačka a v temnu se zahájí měření spotřeby kyslíku. Denně se kontroluje teplota, míchání, coulometrický zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenají se všechny změny barvy obsahu baněk. Spotřeba kyslíku pro 6 baněk se odečítá přímo, např. šestikanálovým zapisovačem, čímž se získá křivka BSK. Na konci kultivace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách a stanoví se zbytková koncentrace zkušební chemické látky a jejích produktů rozkladu a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také koncentrace DOC (postup podle přílohy II, bodu 4). Zvláštní pozornost je třeba věnovat těkavým látkám. Pokud se předpokládá nitrifikace, stanoví se podle možnosti koncentrace dusičnanů a dusitanů.