XI. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU – metoda C.11 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

XI.1 METODA

XI.1.1 ÚVOD
Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mikroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.
Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.
Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.
Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.
Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.
U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC₅₀.
Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,
Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:
— rozpustnost ve vodě,
— tlak par,
— strukturní vzorec,
— čistota zkoušené látky.
Doporučení:
Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.

XI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O₂ na 1 mg kalu za hodinu.
Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:
$1-\frac{2R_S}{{Rc}_1+{Rc}_2}.100=\%inhibice$
kde:
R_s = rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky,
Rc₁ = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 1,
Rc₂ = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 2.
EC₅₀ v této zkoušce je koncentrace zkoušené látky, při které respirační rychlost činí 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkoušky za podmínek popsaných v této metodě.

XI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Jako referenční látku se doporučuje používat známý inhibitor dýchání 3,5-dichlorfenol. Ověřením EC₅₀ u každé dávky aktivovaného kalu by mělo být zkontrolováno, že kal není abnormálně citlivý.

XI.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyživovaného standardním množstvím syntetické odpadní vody se měří po době kontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou časech. Měří se také rychlost dýchání téhož aktivovaného kalu v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkoušené látky při určité koncentraci se vyjadřuje jako procento průměrné rychlosti dýchání ze dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC₅₀ se vypočítá ze stanovení při různých koncentracích.

XI.1.5 KRITÉRIA KVALITY
Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže:
— respirační rychlosti dvou kontrolních pokusů se od sebe liší nejvýše o 15 %,
— EC₅₀ (pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5-dichlorfenolu leží v přijatém rozmezí 5 - 30 mg.l^-1.

XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XI.1.6.1 Činidla

XI.1.6.1.1 Roztoky zkoušené látky
Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l^-1.

XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky
Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H₂SO₄ do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H₂SO₄) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.

XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda
Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:
— 16 g peptonu,
— 11 g masového extraktu,
— 3 g močoviny,
— 0,7 g NaCl,
— 0,4 g CaCl₂.2H₂O,
— 0,2 g MgSO₄.7H₂O,
— 2,8 g K₂HPO₄.
Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD “Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech“ (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.
Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat
v temnu při 0 - 4 °C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.

XI.1.6.2 Aparatura
Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.
Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto:
— měřicí přístroje,
— provzdušňovací zařízení,
— měřič pH a monitorovací zařízení,
— kyslíková elektroda.

XI.1.6.3 Příprava inokula
Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.
Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.
Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).
Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal
v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l^-1. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l^-1.
Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, připraveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 ± 2 °C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.
Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.

XI.1.6.4 Provedení zkoušky

Trvání/doba kontaktu:	30 minut a (nebo) 3 hodiny, během kterých probíhá provzdušňování
Voda:	Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)
Přívod vzduchu:	Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1.
Měřicí aparatura:	Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK.
Měřič obsahu kyslíku:	Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem.
Živný roztok:	Syntetická odpadní voda (viz výše).
Zkoušená látka:	Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky.
Referenční látka:	např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace)
Kontrolní zkouška:	Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky
Teplota:	20 ± 2 °C

Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:
Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).
Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.
V okamžiku “0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C₁).
Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l^-1 a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l^-1.
V okamžiku “15 minut“ (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15-minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.
Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.
Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.
Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.
Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).
Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).

XI.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ
Rychlost dýchání se vypočítá ze záznamu zapisovače mezi přibližně 6,5 mg.l^-1 a 2,5 mg.l^-1, nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační křivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární.
Jestliže rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech neleží v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC₅₀ (za 30 minut nebo tři hodiny) referenční látky neleží v akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l^-1 pro 3,5-dichlorfenol), je zkouška neplatná a musí se opakovat.
Pro každou zkušenou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmicko-pravděpodobnostním) papíru a odečte se hodnota EC₅₀.
Standardními postupy je možné stanovit pro hodnoty EC₅₀ 95% meze spolehlivosti.

XI.3 ZPRÁVA

XI.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
— zkoušená látka: chemické identifikační údaje,
— systém použitý při zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá předběžná úprava aktivovaného kalu,
— experimentální podmínky:
– pH reakční směsi před měřením respirace,
– teplota při zkoušce,
– ba trvání zkoušky,
– referenční látka a její změřená EC₅₀,
– abiotická spotřeba kyslíku (pokud k ní dochází).
— výsledky:
– veškeré naměřené hodnoty,
– křivka inhibice a metoda výpočtu EC₅₀,
– EC₅₀ a je-li možné 95% meze spolehlivosti, EC₂₀ a EC₈₀,
– veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební metody, které mohly ovlivnit výsledek.

XI.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Hodnotu EC₅₀ je třeba považovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkoušené látky buď při zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze přesně simulovat laboratorní zkouškou. Mimoto, zkoušené látky, které mohou mít inhibiční účinky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibiční křivky. Proto je nutné interpretovat tyto křivky opatrně.

XI.4 LITERATURA

(1) International Standard ISO 8192-1986.

(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165

(3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245

(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv), Recommended Method No 103, také popsáno v:

(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80

(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247

(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.