XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XI.1.6.1 Činidla

XI.1.6.1.1 Roztoky zkoušené látky
Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l^-1.

XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky
Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H₂SO₄ do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H₂SO₄) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.

XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda
Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:
— 16 g peptonu,
— 11 g masového extraktu,
— 3 g močoviny,
— 0,7 g NaCl,
— 0,4 g CaCl₂.2H₂O,
— 0,2 g MgSO₄.7H₂O,
— 2,8 g K₂HPO₄.
Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD “Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech“ (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.
Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat
v temnu při 0 - 4 °C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.

XI.1.6.2 Aparatura
Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.
Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto:
— měřicí přístroje,
— provzdušňovací zařízení,
— měřič pH a monitorovací zařízení,
— kyslíková elektroda.

XI.1.6.3 Příprava inokula
Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.
Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.
Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).
Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal
v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l^-1. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l^-1.
Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, připraveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 ± 2 °C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.
Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.

XI.1.6.4 Provedení zkoušky

Trvání/doba kontaktu:	30 minut a (nebo) 3 hodiny, během kterých probíhá provzdušňování
Voda:	Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)
Přívod vzduchu:	Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1.
Měřicí aparatura:	Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK.
Měřič obsahu kyslíku:	Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem.
Živný roztok:	Syntetická odpadní voda (viz výše).
Zkoušená látka:	Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky.
Referenční látka:	např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace)
Kontrolní zkouška:	Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky
Teplota:	20 ± 2 °C

Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:
Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).
Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.
V okamžiku “0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C₁).
Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l^-1 a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l^-1.
V okamžiku “15 minut“ (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15-minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.
Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.
Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.
Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.
Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).
Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).