XV. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY NA RYBÍCH EMBRYÍCH A POTĚRU - KRÁTKODOBÁ ZKOUŠKA – metoda C.15 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku

Sladkovodní
Oncorhynchus mykiss pstruh duhový (9, 16)
Danio rerio danio pruhované (7, 17, 18)
Cyprinus caprio kapr obecný (8, 19)
Oryzias latipes halančík japonský (20, 21)
Pimephales promelas střevle (8, 22)

TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity

Sladkovodní	Mořské
Carassius auratus karas zlatý (8)	Menidia peninsulae (23, 24, 25)
Lepomis macrochirus slunečnice modrá (8)	Clupea harengus sleď (24, 25)
	Gadus morhua treska (24, 25)
	Cyprinodon variegatus (23, 24, 25)

DODATEK 1
NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO)
ÚVOD
Danio pruhované pochází z indického pobřeží Coromandel, kde žije v bystřinách. Je běžnou akvarijní rybou z čeledi kaprovitých. Informace o péči o něj a o jeho chovu jsou uvedeny v standardních příručkách o tropických rybách. Přehled jeho biologie a použití ve výzkumu ryb podává Laale (1).
Ryba zřídka dorůstá délky více než 45 mm. Má válcové tělo se 7 – 9 horizontálními tmavě modrými stříbřitými pruhy. Pruhy pokračují přes ocasní a řitní ploutve. Hřbet má olivově zelený. Samečci jsou štíhlejší než samičky. Samičky jsou stříbrnější a mají rozšířené břicho, zejména před třením.
Dospělé ryby dokáží snášet velké kolísání teploty, pH a tvrdosti vody. Mají-li se získat zdravé ryby poskytující jikry dobré kvality, měly by být zajištěny optimální podmínky.
Při tření sameček sleduje samičku, doráží na ni a při vypuzení jiker je oplodní. Jikry, které jsou průsvitné a nejsou přilnavé, dopadají na dno, kde mohou být pozřeny rodiči. Na tření má vliv světlo. Při odpovídajícím ranním světle se ryby třou v prvních hodinách po rozednění.
Samička může klást v odstupu jednoho týdne dávky o několika tisících jiker.
PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA
Vybere se vhodný počet zdravých ryb, které se alespoň dva týdny před předpokládaným třením udržují ve vhodné vodě (např. dodatek 4). Skupiny ryb by měly mít možnost se před kladením jiker pro zkoušku alespoň jednou vytřít. Hustota obsádky ryb by v tomto období neměla přesáhnout 1 gram ryb na litr. Pravidelná výměna vody nebo použití přečišťovacího systému umožní obsádku zvýšit. Teplota v chovných nádržích se má udržovat na 25 ± 2 °C. Ryby by měly dostávat rozmanitou stravu, která může obsahovat například komerční suché krmivo, čerstvě vylíhnuté Arthemia, chironomidy, dafnie, bílé červy (Enchytraeids).
Dále jsou uvedeny dvě metody, které v praxi vedly k získání dostatečného množství zdravých oplodněných jiker pro provedení zkoušky:
i) Osm samiček a 16 samečků se umístí do nádrže obsahující 50 litrů ředicí vody, chráněné před přímým světlem a ponechají se alespoň 48 h co nejvíce v klidu. Na dno nádrže se odpoledne v den před započetím zkoušky umístí podložka pro tření. Podložka pro tření se skládá z 5 – 7 mm vysokého rámu (z plexiskla nebo jiného vhodného materiálu) s 2 – 5mm hrubým roštem nahoře a s 10 – 30µm jemným roštem vespod. Na hrubém roštu je připevněn třecí substrát vyrobený z nylonových vláken. Poté co byly ryby drženy 12 h v temnu se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Dvě až čtyři hodiny po vytření se podložka pro tření vyjme a jikry se seberou. Podložka pro tření zabrání rybám v požírání jiker a zároveň umožní snadný sběr jiker. Skupiny ryb by se měly před třením určeným k produkci jiker pro zkoušku vytřít alespoň jednou.
ii) Pět až deset samečků a samiček se alespoň dva týdny před zamýšleným třením chová odděleně. Po 5 až 10 dnech se břicha samiček rozšíří a zviditelní se jejich pohlavní papily. Samečci papily nemají. Tření se provede v třecích nádržích opatřených falešným dnem z pletiva (jako výše). Nádrž se naplní ředicí vodou tak, aby voda sahala 5 – 10 cm nad rošt. Jedna samička a dva samečci se umístí do nádrže den před zamýšleným třením. Teplota vody se postupně zvýší jeden stupeň nad aklimatizační teplotu. Vypne se osvětlení a nádrž se ponechá co nejvíce v klidu. Ráno se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Po 2 – 4 h se ryby vyjmou a jikry se seberou. Je-li potřeba více dávek jiker, než lze získat od jedné samičky, nasadí se paralelně dostatečný počet třecích nádrží. Zaznamenáním reprodukční úspěšnosti (množství a kvality) jednotlivých samiček před zkouškou, lze vybrat pro chov samičky s nejvyšší úspěšností.
Jikry se přenesou do zkušebních nádrží skleněnou trubičkou (o vnitřním průměru ne menším než 4 mm) opatřenou pružným nasávacím balónkem. Množství vody, které se přenáší s jikrami, by mělo být co nejmenší. Jikry jsou těžší než voda a z trubičky vypadnou do vody. Je třeba zabránit tomu, aby jikry (a plůdky) přišly do kontaktu se vzduchem. Mikroskopickým vyšetřením vzorku (vzorků) jiker se ověří, že v prvních stádiích vývoje nedošlo k nepravidelnostem. Desinfekce jiker není přípustná.
Mortalita jiker je nejvyšší během prvních 24 h po oplodnění. V této době je často pozorována mortalita 5 – 40 %. Jikry degenerují v důsledku neúspěšného oplodnění nebo vývojových vad. Zdá se, že kvalita dávek jiker závisí na samičce, neboť některé samičky soustavně kladou jikry dobré kvality, jakou jiné samičky neposkytují. Rovněž rychlost vývoje a líhnutí se mezi snůškami liší. Úspěšně oplodněné jikry a plůdky se žloutkovým váčkem přežívají dobře, obvykle jich přežívá více než 90 %. Při 25 °C se z jiker líhnou jedinci po 3 – 5 dnech po oplodnění a žloutkový váček je absorbován přibližně po 13 dnech po oplodnění.
Embryonální vývoj byl dobře popsán Hisaokou a Battlem (2). Díky průsvitnosti jiker a plůdků čerstvě po vylíhnutí lze vývoj ryb dobře sledovat a lze pozorovat malformace. Přibližně čtyři hodiny po vytření lze rozlišit neoplodněné jikry od oplodněných (3). K tomuto vyšetření se jikry a plůdky umístí do nádobky o malém objemu a prohlížejí se pod mikroskopem.
Zkušební podmínky požadované pro časná vývojová stádia jsou uvedena v dodatku 2. Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7,8 a 250 mg/l, vyjádřeno jako CaCO₃.
VÝPOČTY A STATISTIKA
Navrhuje se dvoufázový přístup. V první fázi se statisticky analyzují data o mortalitě, nenormálním vývoji a době líhnutí. Poté se pro ty koncentrace, při nichž nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky na tyto parametry, statisticky vyhodnotí tělesná délka. Tento přístup se doporučuje, neboť toxická látka může selektivně usmrcovat menší ryby, prodlužovat dobu líhnutí a indukovat makroskopické malformace a tedy zkreslovat délku. Kromě toho tak bude pro každou expozici měřen zhruba stejný počet ryb, čímž se zajistí validita statistiky zkoušky.
STANOVENÍ LC₅₀ a EC₅₀
Procento přežití jiker a čerstvých plůdků se vypočte a zkoriguje na mortalitu v kontrolních skupinách podle Abbottovy rovnice (4):
$P=100-\frac{C-P´}{C}\times 100$
kde:
P = korigované procento přežití
P´ = procento přežití pozorované ve zkušební koncentraci
C = procento přežití v kontrolní skupině
Podle možnosti se vhodnou metodou stanoví hodnota LC₅₀ na konci zkoušky.
Požaduje-li se, aby byly do statistiky pro EC₅₀ zahrnuty morfologické odchylky, lze k tomu nalézt návod v práci Stephana (5).
ODHAD LOEC A NOEC
Cílem zkoušky na jikrách a váčkových plůdcích je porovnat koncentrace, u nichž byl pozorovatelný účinek, s kontrolními skupinami, tj. stanovit LOEC. Použije se tedy metoda vícenásobného srovnání (6, 7, 8, 9, 10).
LITERATURA
DODATEK 2
ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY

Druh	Teplota (°C)	Salinita (‰)	Fotoperioda (h)	Délka stádií (d)		Typická délka zkoušky	Přežití v kontrolních skupinách (minimální hodnota v %)
				Embryo	Váčkový plůdek		Úspěšnost líhnutí	Po vylíhnutí
SLADKOVODNÍ
Brachydanio rerio Danio pruhované	25 ± 1	—	12-16	3-5	8-10	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 5 dnů po vylíhnutí (8 - 10 dnů)	80	90
Oncorhynchus mykiss Pstruh duhový	10 ± 1 (1) 12 ± 1 (2)	—	0(3)	30-35	25-30	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 20 dnů po vylíhnutí (50 - 55 dnů)	66	70
Cyprinus carpio Kapr obecný	21-25	—	12-16	5	> 4	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů)	80	75
Oryzias latipes Halančík japonský	24 ± 1 (1) 23 ± 1 (2)	—	12-16	8-11	4-8	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly ) do 5 dnů po vylíhnutí (13 - 16 dnů)	80	80
Pimephales promelas Střevle	25 ± 2	—	16	4-5	5	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů)	60	70

¹ Pro embrya.
² Pro plůdky.
³ Temno pro embrya a plůdky do jednoho týdne po vylíhnutí, s výjimkou okamžiků prohlídky. Poté po dobu zkoušky tlumené světlo.
DODATEK 3
ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY

Druh	Teplota (°C)	Salinita (‰)	Fotoperioda (h)	Délka stádií (d)		Typická délka zkoušky	Přežití v kontrolních skupinách (minimální hodnota v %)
				Embryo	Váčkový plůdek		Úspěšnost líhnutí	Po vylíhnutí
SLADKOVODNÍ
Carassius auratus karas zlatý	24 ± 1	—	—	3-4	> 4	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 4 dnů po vylíhnutí (7 dnů)	—	80
Leopomis macrochirus slunečnice modrá	21 ± 1	—	16	3	> 4	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 4 dnů po vylíhnutí (7 dnů)	—	75
MOŘSKÝ
Menidia peninsulae	22-25	15-22	12	1,5	10	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 5 dnů po vylíhnutí (6 - 7 dnů)	80	60
Clupea harengus Sleď	10± 1	8-15	12	20-25	3-5	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 3 dnů po vylíhnutí (23 - 27 dnů)	60	80
Gadus morhua Treska	5± 1	5-30	12	14-16	3-5	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 3 dnů po vylíhnutí (18 dnů)	60	80
Cyprinodon variegatus	25 ± 1	15-30	12	—	—	Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 4/7 dnů po vylíhnutí (28 dnů)	> 75	80

DODATEK 4
NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY

Látka	Koncentrace
Nerozpuštěné látky	< 20 mg/l
Celkový organický uhlík	< 2 mg/l
Nedisociovaný amoniak	< 1 µg/l
Zbytkový chlor	< 10 µg/l
Celkové organofosforové pesticidy	< 50 ng/l
Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly	< 50 ng/l
Celkový organický chlor	< 25 ng/l

(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173.

(2) Hisaoka K. K., Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), J. Morph., 102, 311 str.

(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrab‰rbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). J. Appl. Ichthyol., 2, 173-181.

(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1-333.

(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster, W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69-81.

(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc, 27, 103-117.

(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc 28, 519-531.

(10) Sokal R. R., Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman, Co., San Francisco.

XV.1 METODA
Tato zkouška krátkodobé toxicity je replikou metody OECD TG 212 (1998).

XV.1.1 ÚVOD
Tato zkouška krátkodobé toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku je krátkodobou zkouškou, při níž jsou exponována životní stádia od čerstvě oplodněných jiker do stadia váčkových plůdků. Při zkoušce na embryu a na váčkovém plůdku se nekrmí, zkouška by tedy měla být ukončena dokud je váčkový plůdek stále vyživován ze žloutkového váčku.
Zkouška je určena k zjištění letálních a v omezené míře subletálních účinků chemických látek na specifická stadia a testovací druhy. Tato zkouška by měla poskytnout užitečné informace, neboť by a) mohla být přechodem mezi letálními a subletálními zkouškami, b) mohla být použita jako screeningová zkouška pro úplnou zkoušku toxicity na časných vývojových stadiích nebo pro zkoušky chronické toxicity a c) mohla by být použita pro zkoušení na druzích, u nichž nejsou dostatečně rozvinuty chovné techniky, aby pokryly období od endogenního k exogennímu vyživování.
Je třeba mít na paměti, že pouze zkoušky pokrývající celý životní cyklus ryb obecně umožňují odhadnout chronickou toxicitu chemické látky pro ryby a že jakékoli omezení expozice nějakého životního stadia může snížit citlivost a tím podhodnotit chronickou toxicitu. Očekává se tedy, že zkouška na embryu a váčkovém plůdku je méně citlivá než úplná zkouška na časných vývojových stádiích, zejména pokud jde o vysoce lipofilní chemické látky (log P_o/v > 4) a chemické látky se specifickým mechanismem účinku. V citlivostech těchto dvou zkoušek se však očekávají menší rozdíly v případě chemických látek s nespecifickým, narkotickým mechanismem účinku (1).
Před publikováním této zkoušky bylo nejvíce zkušeností s touto zkouškou na embryu a váčkovém plůdku získáno u sladkovodní ryby Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – obecný název danio pruhované). Podrobnější pokyny pro zkoušku s tímto druhem jsou tedy uvedeny v dodatku 1. To nevylučuje použití jiného druhu, pro který jsou zkušenosti rovněž k dispozici (tabulky IA a IB).

XV.1.2 DEFINICE
Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.
NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

XV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Embrya a váčkové plůdky se vystaví rozsahu koncentrací zkoušené látky rozpuštěné ve vodě. Zkouška umožňuje volit mezi semistatickým a průtokovým uspořádáním. Volba závisí na povaze zkoušené látky. Zkouška se zahájí umístěním oplodněných jiker do zkušebních nádrží a ukončí se těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku čerstvých plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Posoudí se letální a subletální účinky a porovnají se s kontrolními hodnotami s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky, tedy koncentraci bez pozorovaných účinků. Účinky mohou být eventuálně analyzovány za použití regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která způsobuje určitý procentuálně vyjádřený účinek (tj. LC/EC_x, kde x je definovaný procentuální účinek).

XV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Měly by být dostupné výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku. Výsledky mohou být užitečné při výběru vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkoušce na časných vývojových stádiích. Měly by být známy rozpustnost látky ve vodě (včetně rozpustnosti ve zkušební vodě) a tlak par látky. Měla by být k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek jsou strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pK_a, P_o/v a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).

XV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— celková míra přežití oplodněných jiker v kontrolních skupinách a podle potřeby v nádržích, do nichž bylo přidáno pouze rozpouštědlo, musí být vyšší nebo rovna limitům stanoveným v dodatcích 2 a 3,
— koncentrace rozpuštěného kyslíku musí ležet mezi 60 a 100 % nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,
— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi nebo den ode dne lišit o více než ± 1,5 °C a měla by být udržována v rozpětí teplot stanoveném pro zkušební druh (dodatky 2 a 3,).

XV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XV.1.6.1 Zkušební nádrže
Mohou být použity jakékoli nádrže ze skla nebo z jiného inertního materiálu. Rozměry zkušebních nádrží by měly být dostatečné k tomu, aby vyhovovaly velikosti násady (viz bod 1.7.1.2). Doporučuje se, aby byly nádrže umístěny ve zkušebním prostoru náhodně. Uspořádání do náhodných bloků s možností expozice v každém bloku se upřednostňuje před zcela náhodným uspořádáním, když existují systémové účinky v laboratoři, které mohou být blokovým uspořádáním kontrolovány. Je-li použito blokové uspořádání, mělo by být zohledněno při následné analýze dat. Nádrže by měly být chráněny před nežádoucími rušivými vlivy.

XV.1.6.2 Výběr druhů ryb
Doporučené druhy ryb jsou uvedeny v tabulce 1A. To nevylučuje použití jiného druhu (příklady jsou uvedeny v tabulce 1B), zkušební postup musí být ale upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

XV.1.6.3 Chov matečných ryb
Podrobnosti o chovu matečných ryb v uspokojivých podmínkách jsou uvedeny v metodě OECD TG 210 ⁽¹⁾ a v literatuře (2, 3, 4, 5, 6).

XV.1.6.4 Chov embryí a plůdků
Embrya a čerstvě vykulené plůdky mohou být exponovány v hlavní nádrži v menších nádobách s pletivovými stěnami nebo uzávěry, aby jimi mohl proudit zkušební roztok. Nevířivého průtoku nádobami lze dosáhnout jejich zavěšení do ramen, pomocí nichž lze pohybovat nádobami nahoru a dolů, přičemž organismy zůstanou stále ponořeny; lze rovněž použít syfonový systém přítoku a výpusti. Oplodněné jikry lososovitých ryb mohou ležet na podložce nebo pletivu s dostatečně velkými oky, aby jimi mohly plůdky po vylíhnutí propadnout. K přemístění embryí a plůdků v semistatické zkoušce s každodenní úplnou výměnou média je vhodné použít Pasteurovy pipety. (viz bod 1.6.6).
Jsou-li k udržení jiker v hlavní nádrži použity nádoby, mřížky nebo pletiva, měly by být po vylíhnutí plůdků odstraněny ⁽¹⁾, pokud ovšem nemají být ponechány k zamezení úniku ryb. Je-li třeba plůdky přemístit, neměly by být vystaveny vzduchu a neměly by se k jejich vytažení z nádob používat síťky (taková opatrnost není nutná u méně křehkých druhů, např. u kapra). Okamžik přemístění se liší podle druhu a nemusí být vždy nutný. U semistatických technik mohou být použity kádinky nebo mělké nádobky a podle potřeby mohou být opatřeny sítem umístěným nepatrně nad dnem kádinky. Je-li objem těchto nádob dostatečný, aby vyhovoval požadavkům na nasazování (viz bod 1.7.1.2) nemusí být přemístění embryí nebo plůdků nutné.

XV.1.6.5 Voda
Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoliv voda, která vyhovuje chemickým charakteristikám přijatelné ředicím vody, jak jsou uvedeny v dodatku 4 a v níž testovací druhy kontrolních skupin přežívají alespoň tak, jak je uvedeno v dodatcích 2 a 3. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. pH by se nemělo měnit o více než ± 0,5. Pro ujištění, že ředící voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkoušenou látkou) nebo nepříznivý vliv na stav matečných ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO₄), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).

XV.1.6.6 Zkušební roztoky
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.
Zásobní roztok by měl být nejlépe připraven jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním a sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony. Neměla by být používána rozpouštědla nebo dispergátory (solubilizační činidla), v některých případech však může být použití takových látek pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na přežití ani viditelné nepříznivé účinky na časná vývojová stádia, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu. Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.
U semistatických technik mohou být použity dva různé postupy obměny; buď i) se do čistých nádob připraví nové zkušební roztoky a přežívající jikry a plůdky se s malým objemem starého roztoku opatrně přemístí do nových nádob, aniž by se vystavily vzduchu, nebo ii) se testovací organismy ponechají v nádobě a vymění se určitý podíl (alespoň tři čtvrtiny) zkušební vody. Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat médium denně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška. V každém případě je třeba dbát na to, aby plůdky nebyly při obnovování vody vystaveny stresu.
Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Jako vhodný by shledán průtok zajišťující výměnu alespoň pěti objemů nádrže za 24 h (2).

XV.1.7 POSTUP
Užitečné informace o provádění zkoušek toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku jsou dostupné v literatuře, přičemž některé literární zdroje (7, 8, 9) jsou uvedeny v tomto textu v oddílu s literaturou.

XV.1.7.1 Podmínky expozice

XV.1.7.1.1 Délka expozice
Zkouška se zahájí nejlépe do 30 minut po oplodnění jiker. Embrya se ponoří do zkušebního roztoku před započetím rýhování blastuly, nebo co nejdříve po něm, a v každém případě před počátkem stádia gastruly. U jiker získaných od komerčního dodavatele nemusí být možné zahájit zkoušku ihned po oplodnění. Vhledem k tomu, že citlivost zkoušky může být závažně ovlivněna zpoždění začátku zkoušky, měla by být zkouška zahájena do osmi hodin po oplodnění. Vzhledem k tomu, že se plůdky v průběhu expozice nekrmí, ukončí se zkouška těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku u plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Délka zkoušky bude záviset na použitém druhu. Některé doporučené délky zkoušky jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3.

XV.1.7.1.2 Nasazování
Počet oplodněných jiker na začátku zkoušky by měl být dostatečný ke splnění statistických požadavků. Měly by být k expozici náhodně rozděleny a na jednu koncentraci by mělo být rozděleno alespoň 30 jiker rovným dílem (nebo alespoň jak je to jen možné s ohledem na to, že u některých druhů může být obtížné získat stejně velké podíly) mezi alespoň tři další zkušební nádrže. Velikost násady (biomasa v jednotce objemu) by měla být tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. U průtokových zkoušek se doporučuje nasazování nepřekračující 0,5 g/l za 24 h a v žádném okamžiku nepřekračující 5 g/l roztoku (2).

XV.1.7.1.3 Světlo a teplota
Fotoperioda a teplota zkušební vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatky 2 a 3). Pro sledování teploty může sloužit další zkušební nádrž.

XV.1.7.2 Zkušební koncentrace
Obvykle je nezbytných pět koncentrací zkoušené látky lišících se od sebe faktorem nepřekračujícím 3,2. Při výběru rozsahu zkušebních koncentrací by měla být zohledněna křivka závislosti hodnoty LC₅₀ na délce expozice ve studii akutní toxicity. Za určitých okolností může být oprávněné použít méně než pět koncentrací, např. v limitní zkoušce, a užší rozsah koncentrací. Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Koncentrace látky, které jsou vyšší než 96hodinová LC₅₀ nebo vyšší než 100 mg/l, podle toho, co je nižší, nemusí být zkoušeny. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušební vodě.
Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo (viz bod 1.6.6), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádrži vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná.

XV.1.7.3 Kontrolní skupiny
Jako další zkušební sady by měly být nasazeny kontrolní skupina v ředicí vodě (příslušným způsoben znásobená) a podle potřeby také jedna kontrolní skupina se solubilizačním činidlem (příslušným způsoben znásobená).

XV.1.7.4 Častost analytických stanovení a měření
Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky stanovují v pravidelných intervalech.
U semistatických zkoušek, pokud se předpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 %, viz bod 1.4 a 1.6.6), se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením alespoň v nejméně třech nádržích (tj. analýzy se provedou na vzorku téhož roztoku – ihned po jeho přípravě a při jeho výměně).
U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) předpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí větším než ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkoušené koncentrace ihned po jejich přípravě a před jejich výměnou, a to stejně často (tj. alespoň ve třech okamžicích rovnoměrně rozložených přes celkovou dobu zkoušky). Stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením je třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádrže. Stanovení se provádějí v odstupu ne více než 7 dnů. Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace uspokojivě udržována v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách.
Pro průtokové zkoušky je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Je-li zkouška delší než sedm dnů, doporučuje se zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé.
Může být nezbytné vzorky odstředit nebo filtrovat (např. přes filtr s velikostí pórů 0,45 µm). Vzhledem k tomu, že však odstředění ani filtrace vždy neoddělí od sebe biologicky dostupný a biologicky nedostupný podíl zkušební látky, nemusí být vzorky takto zpracovány.
V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost a solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u semistatických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří denně, nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.

XV.1.7.5 Pozorování

XV.1.7.5.1 Stádia vývoje embrya
Embryonální stádium (tj. stadium gastruly) na začátku expozice zkoušené látce by mělo být identifikováno co nejpřesněji. Lze to provést za použití reprezentativního vzorku vhodně uchovávaných a očištěných jiker. Popis a vyobrazení embryonálních stádií lze také nalézt v literatuře (2, 5, 10, 11).

XV.1.7.5.2 Líhnutí a přežívání
Líhnutí a přežívání se pozoruje alespoň jednou denně a zaznamenávají se počty. Může být žádoucí provádět na začátku zkoušky častější pozorování (např. každých 30 min během prvních tří hodin), neboť v některých případech mohou být důležitější doby přežití než pouhé počty úhynů (např. dochází-li k akutním toxickým účinkům). Uhynulá embrya a plůdky se odstraní ihned po nalezení, neboť se rychle rozkládají. Při odstraňování uhynulých jedinců se postupuje s mimořádnou opatrností, aby se nezasáhlo do sousedních jiker/plůdků nebo aby se tyto fyzicky nepoškodily, neboť jsou mimořádně subtilní a citlivé. Kritéria uhynutí se u životních stádií liší:
— u jiker: zejména v časných stádiích zřetelná ztráta průsvitnosti a změna ve zbarvení vyvolané koagulací a/nebo sražením bílkovin vedoucími k bílému zakalení,
— u embryí: absence pohybu nebo tepu srdce nebo neprůsvitné zbarvení u druhů, jejichž embrya jsou za normálních okolností průsvitná,
— u plůdků: nepohyblivost nebo absence dýchacích pohybů nebo tepu srdce nebo bílé neprůsvitné zbarvení centrálního nervového systému a nedostatečná reakce na mechanické podněty.

XV.1.7.5.3 Neobvyklý vzhled
Počet plůdků vykazujících neobvyklý tělesný vzhled nebo pigmentaci a stav absorpce žloutkového váčku se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky a na povaze popisované odchylky. Je třeba si uvědomit, že neobvyklá embrya a plůdky se přirozeně vyskytují a u některých druhů jich může být v kontrolních skupinách řádově několik procent. Neobvyklí jedinci by měli být ze zkušební nádrže odstranění pouze v případě uhynutí.

XV.1.7.5.4 Neobvyklé chování
Odchylky, např. hyperventilace, nekoordinované plavání a netypická nečinnost se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky. Tyto účinky, přestože je obtížné je kvantifikovat, mohou – jsou-li pozorovány – napomoci interpretovat data o mortalitě, tj. mohou poskytnout informace o mechanismu toxického působení látky.

XV.1.7.5.5 Tělesná délka
Na konci zkoušky se doporučuje změřit individuální délku: může být změřena standardní délka, délka těla (the fork lenght) nebo celková délka. Došlo-li však k uhnití ocasní ploutve nebo k erozi ploutví, použije se standardní délka. Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro délku mezi jednotlivými kontrolními skupinami ≤ 20 %.

XV.1.7.5.6 Hmotnost
Na konci se zkoušky lze stanovit jednotlivé hmotnosti; hmotnost za sucha (24 h při 60 °C) se upřednostňuje před živou váhou (po osušení do sucha). Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro hmotnost mezi jednotlivými kontrolními skupinami ≤ 20 %.
Tato pozorování povedou k některým nebo ke všem následujícím údajům, které budou k dispozici pro statistickou analýzu:
— kumulativní mortalita,
— počet zdravých plůdků na konci zkoušky,
— čas začátku líhnutí a konce líhnutí (tj. 90% vylíhnutí v každé paralelní skupině),
— počet plůdků vylíhnutých každý den,
— délka (a hmotnost) ryb, které přežily do konce zkoušky,
— počet plůdků, které jsou deformované nebo mají neobvyklý vzhled,
— počet plůdků vykazujících neobvyklé chování.

XV.2 DATA A ZPRÁVY

XV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, ve výchozím počtu oplodněných jiker v měřených parametrech. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.
Mají-li být odhadnuty hodnoty LOEC/NOEC, bude nezbytné analyzovat odchylky pro každou sadu paralelních skupin pomocí analýzy variance (ANOVA) nebo pomocí kontingenční tabulky. K vícenásobnému porovnání výsledků pro jednotlivé koncentrace a pro kontrolní skupiny může být užitečný Dunnettův test (12, 13). K dispozici jsou další užitečné příklady (14, 15). Vypočte se a uvede stupeň účinku, který lze prokázat pomocí ANOVA nebo jiných metod (tj. vypovídací schopnost zkoušky). Je třeba si uvědomit, že ne všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6 jsou vhodná pro statistickou analýzu pomocí ANOVA. Například kumulativní mortalita a počet zdravých plůdků na konci zkoušky by mohly být analyzovány probitovými metodami.
Mají-li být odhadnuty LC nebo EC_x, proloží se daty vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka nebo křivky by měly být tak parametrizovány, aby bylo možné přímo odhadnout požadované hodnoty LC nebo EC_x a jejich směrodatné odchylky. To značně usnadňuje výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnoty LC nebo EC_x. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. Proložení lze provést graficky. Regresní analýza je vhodná pro všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6.

XV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že se naměřené koncentrace toxické látky ve zkušebních roztocích pohybují na úrovních blízkých mezi stanovitelnosti analytické metody. Interpretace výsledků pro koncentrace vyšší než je rozpustnost látky ve vodě by měla být rovněž opatrná.

XV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XV.2.3.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
— údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.

XV.2.3.2 Testovací druh
— vědecký název, kmen, počet matečných ryb (tj. kolik samiček bylo ve zkoušce použito pro opatření požadovaného počtu jiker), zdroj a metoda sběru oplodněných jiker a následné zpracování.

XV.2.3.3 Zkušební podmínky
— použitá zkušební metoda (např. semistatická nebo průtoková metoda, doba od oplodnění do začátku zkoušky, nasazování atd.),
— fotoperioda (fotoperiody),
— uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží a jejich znásobení, počet embryí v nádrži),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (je-li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
— nominální zkušební koncentrace, naměřené hodnoty ve zkušebních nádržích, jejich střední hodnoty a směrodatné odchylky a metody jejich stanovení a je-li zkoušená látka rozpustná ve vodě v koncentracích nižších, než jsou vyšetřované koncentrace, uvede se důkaz toho, že naměřené koncentrace odpovídají koncentraci zkoušené látky v roztoku,
— charakteristiky ředicí vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,
— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku.

XV.2.3.4 Výsledky
— výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,
— doklady o tom, že kontrolní skupiny splnily obecné požadavky na přijatelnost přežití pro testovací druh (dodatky 2 a 3,),
— údaje o mortalitě nebo přežití v embryonálním stádiu a ve stádiu plůdku a údaje o celkové mortalitě nebo přežití,
— doba do vylíhnutí, počet vylíhnutých jedinců,
— údaje o délce (a hmotnosti),
— výskyt a popis morfologických odchylek, pokud se vyskytly,
— výskyt a popis účinků na chování, pokud se vyskytly,
— statistická analýza a zpracování dat,
— u zkoušek analyzovaných pomocí ANOVA nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p = 0,05 a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) pro každou posuzovanou reakci, včetně popisu použité statistické metody a údaje o tom, jak velký účinek bylo možné odhalit,
— u zkoušek analyzovaných pomocí regresních metod, hodnoty LC a EC_x a intervaly spolehlivosti a graf proloženého modelu použitého pro jejich výpočet,
— vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.

XV.3 LITERATURA

(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 str., červen 1990.

(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 str.

(3) Brauhn J. L., Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. str. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

(4) Brungs W. A., Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. str. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121-173.

(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328-330.

(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B., Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environ. Toxicol. Chem., 6, 61-71.

(8) Birge J. W., Black J. A., Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environ. Toxicol. Chem., 4, 807-821.

(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A., Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145.

(10) Kirchen R. V., W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.

(11) Kirchen R. V., W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 str.

(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H., Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Filadelfie.

(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M., Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321-334.

(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, prosinec 1992, 81 str.

(17) Dave G., Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 21, 126-134.

(18) Meyer A., Bierman C. H., Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236.

(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F., Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicol. Environ. Safety, 32, 19-28.

(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, prosinec. 1991, EPA, Duluth.

(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H., Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1189-1203.

(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 str.

(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, v: W. S. Hoar, D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1-58.