XX. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO REPRODUKCI U DAPHNIA MAGNA – metoda C.20 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
DODATEK 1
PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4
Aklimatizace na Elendtova média M7 M4
Některé laboratoře narazily na obtíže při přímém přenosu dafnií do médií M4 (1) a M7. Určitého úspěchu však bylo dosaženo postupnou aklimatizací, tj. přenesením z vlastního média do 30% Elendtova média, poté do 60% Elendtova média a nakonec do 100% Elendtova média. Délky doby aklimatizace mohou být až jeden měsíc.
PŘÍPRAVA
Stopové prvky
Ve vodě vhodné čistoty, např. v deionisované nebo destilované vodě nebo ve vodě přečištěné reverzní osmosou, se nejprve připraví samostatné zásobní roztoky (I) jednotlivých stopových prvků (I). Z těchto oddělených zásobních roztoků (I) se připraví jeden zásobní roztok (II) obsahující všechny stopové prvky (směsný roztok), tj.:

Zásobní roztoky I (jednotlivá látka)	Množství přidané do vody (mg·l-1)	Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek)	Kombinovaný zásobní roztok II se připraví přidáním následujícího množství zásobního roztoku I do vody (ml·l-1)
			M 4	M 7
H3BO3	57 190	20 000	1,0	0,25
MnCl2·4H2O	7 210	20 000	1,0	0,25
LiCl	6 120	20 000	1,0	0,25
RbCl	1 420	20 000	1,0	0,25
SrCl2·6H2O	3 040	20 000	1,0	0,25
NaBr	320	20 000	1,0	0,25
Na2MoO4·2H2O	1 260	20 000	1,0	0,25
CuCl2·2H2O	335	20 000	1,0	0,25
ZnCl2	260	20 000	1,0	1,0
CoCl2·6H2O	200	20 000	1,0	1,0
KI	65	20 000	1,0	1,0
Na2SeO3	43,8	20 000	1,0	1,0
NH4VO3	11,5	20 000	1,0	1,0
Na2EDTA·2H2O	5 000	2 000	—	—
FeSO4·7H2O	1 991	2 000 n	—	—
Jak roztok Na2EDTA, tak roztok FeSO4 se připraví samostatně, spojí se a ihned se autoklávují. Získají se:
2 litry roztoku Fe-EDTA		1 000	20,0	5,0

Média M4 a M7
Média M4 a M7 se připraví ze zásobního roztoku II, makroživin a vitaminů následujícím způsobem:

	Množství přidané do vody (mg·l-1)	Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek)	Množství zásobního roztoku přidané za účelem přípravy média (ml·l-1)
			M 4	M 7
Zásobní roztok II obsahující kombinaci stopových prvků		20	50	50
Zásobní roztok makroživin (jednotlivá látka)
CaCl2·2H2O	293 800	1 000	1,0	1,0
MgSO4·7H2O	246 600	2 000	0,5	0,5
KCl	58 000	10 000	0,1	0,1
NaHCO3	64 800	1 000	1,0	1,0
Na2SiO3·9H2O	50 000	5 000	0,2	0,2
NaNO3	2 740	10 000	0,1	0,1
KH2PO4	1 430	10 000	0,1	0,1
K2HPO4	1 840	10 000	0,1	0,1
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok	—	10 000	0,1	0,1
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se připraví přidáním 3 vitaminů do 1 litru vody takto:
Thiamin-hydrochlorid	750	10 000	—	—
Kyanokobalamin (B12)	10	10 000	—	—
Biotin	7,5	10 000	—	—

Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se uchovává v malých hluboce zmrazených podílech. Vitaminy se přidají do média krátce před použitím.
Poznámky: Aby nedošlo při přípravě kompletního média k vysrážení solí, přidají se podíly zásobních roztoků do asi 500 – 800 ml deionisované vody a objem se poté doplní na 1 litr.
Poprvé byly informace o médiu M4 uvedeny v práci Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25-33.
DODATEK 2
ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS
Je pochopitelné, že obsah uhlíku v krmivu na bázi řas se nebude normálně měřit přímo, ale stanoví se z korelací (tj. z nomogramů) se zástupnými ukazateli, jako jsou počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle.
TOC by měl být stanoven spíše vysokoteplotní oxidací než pomocí UV nebo persíranovou metodou. (Viz: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
Pro účely vytvoření nomogramu se řasy oddělí od růstového média centrifugací a poté se resuspendují v destilované vodě. Zástupný ukazatel a koncentrace TOC se měří v každém vzorku trojmo.
Provede se analýza slepého pokusu s destilovanou vodou a jeho koncentrace TOC se odečte od koncentrace TOC ve vzorku s řasami.
Nomogram by měl být lineární v požadovaném rozsahu koncentrací uhlíku. Příklady jsou uvedeny níže.
Upozornění: Tyto příklady nelze pro účely přepočtu použít; je důležité, aby si laboratoře připravily vlastní nomogramy.



DODATEK 3
PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ

DODATEK 4
PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY
DODATEK 5
VÝPOČET ČASOVĚ VÁŽENÉ STŘEDNÍ HODNOTY
Časově vážená střední hodnota
Vzhledem k tomu, že mezi výměnami média může koncentrace zkoušené látky klesat, je nezbytné zvážit, jaká koncentrace bude považována za reprezentativní pro rozsah koncentrací, jimž byly dospělé dafnie vystaveny. Výběr by měl být založen na biologických i statistických úvahách. Vychází-li se například z toho, že reprodukce je ovlivňována hlavně maximální koncentrací, jíž byl organismus vystaven, měla by být tedy použita maximální koncentrace. Považuje-li se však za významnější akumulované nebo dlouhodobé působení toxické látky, má větší opodstatnění průměrná koncentrace. V takovém případě je vhodným průměrem časově vážená střední koncentrace, neboť zohledňuje časové změny okamžité koncentrace.

Obrázek 1: Příklad časově vážené střední hodnoty
Na obrázku 1 je znázorněn příklad (zjednodušené) zkoušky trvající sedm dní s obnovou média v den 0, 2 a 4.
— Tenká klikatá čára znázorňuje koncentraci v kterémkoli okamžiku. Má se za to, že pokles koncentrace sleduje proces exponenciálního rozkladu buněk.
— Šest vyznačených bodů představuje koncentrace naměřené na začátku a na konci období mezi obnoveními média.
— Silná plná čára vyznačuje hodnotu časově vážené střední hodnoty.
Časově vážená střední hodnota je vypočtena tak, aby se plocha pod čarou pro časově váženou střední hodnotu rovnala ploše pod čarou průběhu koncentrace. Výpočet pro výše uvedený příklad je ilustrován v tabulce 1.
Tabulka 1: Výpočet časově vážené střední hodnoty

Obnovení média č.	Dny	Konc0	Konc1	ln(Konc0)	ln(Konc1)	Plocha
1	2	10 000	4,493	2,303	1,503	13,767
2	2	11 000	6,037	2,398	1,798	16,544
3	3	10 000	4,066	2,303	1,403	19,781
Celkový počet dnů: 7					Celková plocha	50,091
					ČV střední hodnota	7,156

„Dny“ se rozumí počet dnů mezi obnoveními média.
„Konc₀“ je naměřená koncentrace na začátku období mezi obnoveními média.
„Konc₁“ je naměřená koncentrace na konci období mezi obnoveními média.
„ln (Konc₀)“ je přirozený logaritmus Konc₀.
„ln (Konc₁)“ je přirozený logaritmus Konc₁.
„Plocha“ je plocha pod exponenciální křivkou pro každé období mezi obnoveními média.
Vypočte se z rovnice:
$Plocha=\frac{{Konc}_0-{Konc}_1}{\ln {Konc}_0-\ln {Konc}_1}\times Dny$
Časově vážená střední hodnota („ČV střední hodnota“) se vypočte jako podíl „celkové plochy“ a „celkového počtu dnů“.
Pro zkoušku toxicity pro reprodukci na dafniích se tabulka pochopitelně rozšíří tak, aby pokrývala 21 dnů.
Je zřejmé, že provádí-li se měření pouze na začátku a na konci období mezi obnoveními média, není možné potvrdit, že proces rozkladu je skutečně exponenciální. Jiná křivka by vedla k jinému způsobu výpočtu „Plochy“. Exponenciální rozklad však není nepřijatelný a jemu odpovídající křivka je pravděpodobně nejideálnější, chybí-li jiné informace.
Je však nezbytné postupovat opatrně, není-li v médiu na konci období mezi jeho obnoveními zjištěno žádné množství zkušební látky. Není-li možné odhadnout, jak rychle látka z roztoku zmizela, není možné získat realistickou plochu pod křivkou a není tedy možné získat rozumnou časově váženou střední hodnotu.

a) Naměřené koncentrace

Nominální koncentrace	Vzorek z týdne 1		Vzorek z týdne 2		Vzorek z týdne 3
	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium

b) Naměřené koncentrace vyjádřené v procentech nominální koncentrace

Nominální koncentrace	Vzorek z týdne 1		Vzorek z týdne 2		Vzorek z týdne 3
	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium	Čerstvé médium	Staré médium

XX.1 METODA
Tato zkouška toxicity pro reprodukci je replikou metody OECD TG 211 (1998).

XX.1.1 ÚVOD
Hlavním cílem zkoušky je posoudit účinky chemických látek na reprodukční schopnost druhu Daphnia magna.

XX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Matečné organismy: dafnie samičího pohlaví, které jsou přítomné na začátku zkoušky a jejich reprodukční schopnost je předmětem studie.
Potomstvo: mladé dafnie pocházející z matečných organismů v průběhu zkoušky.
Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace, při níž je pro danou expoziční dobu pozorován statisticky významný účinek látky na reprodukci a na mortalitu matečných organismů (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou, v průběhu stanovené expoziční doby. Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dvě podmínky splnit, musí podrobně vysvětleno jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.
Koncentrace bez pozorovaných účinků (no observed effect concentration, NOEC): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC, která při srovnání s kontrolní skupinou nemá pro danou expoziční dobu statisticky významný účinek (p < 0,05).
EC_x: je koncentrace zkoušené látky rozpuštěné ve vodě, která pro danou expoziční dobu vede k x% snížení reprodukce dafnií Daphnia magna.
Imanentní růst populace: je míra růstu populace, v níž je zahrnuta reprodukční schopnost a mortalita specifická z hlediska stáří (20, 21, 22). V ustáleném stavu bude nulový. Pro rostoucí populaci bude kladný a pro snižující se populaci bude záporný. Je zřejmé, že při záporném růstu nelze druh zachovat a nakonec dojde k jeho vyhynutí.
Mez detekovatelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku detekovat, nikoli však stanovit.
Mez stanovitelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku kvantitativně naměřit.
Mortalita: organismus se zaznamená jako mrtvý, je-li nepohyblivý, tj. není-li schopen plavat nebo není-li u končetin (přívěsků) nebo u postabdomen pozorován pohyb do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádobou. (Použije-li se jiná definice, musí být uvedena společně s literární odkazem.)

XX.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Mladé samičí dafnie (matečné organismy) na začátku zkoušky mladší než 24 h se exponují zkoušené látce přidané do vody v určitém rozsahu koncentrací. Zkouška trvá 21 dní. Na konci zkoušky se odhadne celkový počet vylíhnutých živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. To znamená, že nedospělé dafnie pocházející z dospělých dafnií, které v průběhu zkoušky uhynuly, se z odhadů vyloučí. Reprodukční schopnost matečných organismů lze vyjádřit jiným způsobem (např. jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu za den, a to od prvního dne, kdy bylo potomstvo pozorováno), který se však uvede doplňkově vedle celkového počtu nedospělých dafnií pocházejících z jedné matečné dafnie živé na konci zkoušky. Reprodukční schopnost organismů exponovaných zkoušené látce se porovná s reprodukční schopností kontrolní skupiny (kontrolních skupin) s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC). Kromě toho se data pokud možno analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% snížení reprodukční schopnosti, (tj. EC₅₀, EC₂₀ nebo EC₁₀).
Musí být rovněž uvedeno přežití matečných organismů a okamžik narození vylíhnutí prvních potomků. Zkoumány mohou být také jiné účinky vyvolané látkou, které mají vliv na charakteristiky, jako jsou růst (např. vliv na délku) a případně imanentní růst populace.

XX.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Měly by být k dispozici výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.2, část I) provedené u Daphnia magna. Výsledky mohou být užitečné pro volbu vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkouškách toxicity pro reprodukci. Měly by být známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a měla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženým výtěžkem a mezí stanovitelnosti.
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pK_a, P_ov a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).

XX.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být u kontrolní skupiny (kontrolních skupin) splněna následující kriteria reprodukční schopnosti:
— mortalita matečných organismů (dafnií samičího pohlaví) nesmí na konci zkoušky překročit 20 %,
— střední hodnota počtu živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu živého na konci zkoušky je ≥ 60.

XX.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XX.1.6.1 Přístroje a pomůcky
Zkušební nádoby nebo jiné přístroje a pomůcky, které přijdou do styku se zkušebními roztoky, by měly být skleněné nebo z jiného chemicky inertního materiálu. Zkušebními nádobami jsou obvykle skleněné kádinky.
Kromě toho bude nezbytné některé nebo veškeré následující zařízení:
— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
— vhodný přístroj pro regulaci teploty,
— pH-metr,
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
— zařízení pro stanovení celkového organického uhlíku (TOC) ve vodě nebo zařízení pro stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK),
— vhodné zařízení pro ovládání režimu osvětlení a pro měření intenzity světla.

XX.1.6.2 Testovací organismy
Ke zkoušce se použije druh Daphnia magna Straus. Jiné druhy dafnií mohou být použity, pokud splňují případná kritéria validity (kriterium validity týkající se reprodukční schopnosti kontrolních skupin by mělo být relevantní pro daný druh dafnií). Použijí-li se jiné druhy dafnií, musí být jasně identifikovány a jejich použití musí být zdůvodněno.
Klon by měl být identifikován nejlépe uvedením genotypu. Výzkum ukázal (1), že reprodukční schopnost klonu A (který pochází z institutu IRCHA ve Francii) (3) stabilně splňuje kriterium validity, jímž je ≥ 60 potomků na přeživší matečný organismus při kultivaci za podmínek popsaných v této metodě. Splňuje-li kultura dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku jsou přijatelné i jiné klony.
Na začátku zkoušky musí být dafnie 24 h staré a nesmí být první generací. Musí pocházet ze zdravé kultury (tj. nesmí vykazovat známky stresu projevující se vysokou mortalitou, přítomnost jedinců samčího pohlaví a epifií, zpoždění produkce prvních potomků, přítomnost jinak zbarvených jedinců atd.). Organismy ze zásobní kultury musí být chovány v podmínkách podobných těm, které mají být použity při zkoušce (osvětlení, teplota, médium, krmení a počet dafnií na jednotku objemu). Liší-li se kultivační médium pro dafnie, které má být použito při zkoušce, od média používaného k rutinní kultivaci dafnií, doporučuje se zařadit před zkouškou obvykle třítýdenní aklimatizační období (tj. v délce odpovídající jedné generaci), aby nedošlo u matečných organismů ke stresu.

XX.1.6.3 Zkušební médium
Doporučuje se, aby bylo v této zkoušce použito přesně definované médium. Tím se lze vyhnout použití přísad, které je obtížné charakterizovat (např. mořských řas, půdy, extraktu atd.) a zvýšit vyhlídky mezilaboratorní standardizace. Jako vyhovující pro tento účel byla shledána Elendtova média M4 (4) a M7. Přijatelná jsou však i jiná média (např. (5, 6)), splňuje-li při jejich použití reprodukční schopnost kultury dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku.
Použije-li se médium, které obsahuje nedostatečně charakterizovatelné přísady, měly by být tyto přísady jasně specifikovány a v protokolu o zkoušce se uvedou informace o jejich složení, to zejména o obsahu organického uhlíku, neboť může přispívat k dodávané stravě. Doporučuje se, aby byl stanoven celkový organický uhlík (TOC) a/nebo chemická spotřeba kyslíku (CHSK) výchozí formy organické přísady a aby byl odhadnut výsledný příspěvek k TOC nebo CHSK ve zkušebním médiu. Doporučuje se, aby byly úrovně TOC v médiu (tj. před přidáním řas) nižší než 2 mg·l^-1 (7).
Při zkoušení látek obsahujících kovy je důležité si uvědomit, že vlastnosti zkušebního média (např. tvrdost, chelatační schopnosti) mohou mít vliv na toxicitu látky. Z tohoto důvodu je žádoucí, aby bylo médium přesně definováno. V současnosti jsou však jedinými přesně definovanými médii, o nichž je známo, že jsou vhodná pro dlouhodobou kultivaci kultury druhu Daphnia magna, Elendtova média M4 a M7. Obě média obsahují chelatační činidlo EDTA. Práce (2) ukázala, že provádí-li se zkouška v médiích M4 a M7, je „zdánlivá toxicita“ kadmia zpravidla nižší než v médiu, které neobsahuje EDTA. Média M4 a M7 se tedy nedoporučují pro zkoušení látek obsahujících kovy a neměla by se používat ani jiná média obsahující činidla známá svojí chelatační schopností. V případě látek obsahujících kovy se doporučuje používat jiné médium, například rekonstituovanou tvrdou sladkou vodu podle ASTM (7), která neobsahuje EDTA a do níž je přidán extrakt z řas (8). Tato kombinace rekonstituované tvrdé sladké vody podle ASTM a extraktu z řas je také vhodná pro dlouhodobou kultivaci druhu Daphnia magna (2) a pro zkoušení na tomto druhu, přestože vykazuje slabé chelatační účinky způsobené organickými složkami přidaného extraktu z řas.
Na začátku zkoušky a v jejím průběhu by měla být koncentrace rozpuštěného kyslíku vyšší než 3 mg·l^-1. pH by mělo být v rozmezí 6 až 9 a zpravidla by se nemělo v žádné zkoušce měnit o více než 1,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg·l^-1 (jako CaCO₃). Ve zkouškách při této a vyšší tvrdosti reprodukční schopnost prokazatelně vyhovovala kritériím validity (9, 10).

XX.1.6.4 Zkušební roztoky
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se obvykle připraví ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky se připraví nejlépe rozpuštěním látky ve zkušebním médiu.
Pro přípravu vhodně koncentrovaného zásobního roztoku může být někdy nezbytné použití organických rozpouštědel nebo dispergátorů, měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, 0,01% methylcellulosa a HCO-40. V žádném případě by však neměl být obsah zkušební látky ve zkušebních roztocích vyšší než je její rozpustnost ve zkušebním médiu.
K přípravě zásobního roztoku, který lze přesně dávkovat do vody, se použijí rozpouštědla. Při doporučené koncentraci rozpouštědla v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l^-1) nejsou výše uvedená rozpouštědla toxická a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.
Dispersanty mohou usnadnit přesné dávkování a dispergaci. Při doporučené koncentraci v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l^-1) nejsou výše uvedené dispergátory toxické a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.

XX.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
Expozice se rozvrhne pro jednotlivé zkušební nádoby a veškeré další obsluhování zkušebních nádob se provádí náhodně. Nedodržení této zásady může vést k jednostrannému vychýlení, které může být považováno za účinek koncentrace. Jsou-li například experimentální jednotky obsluhovány v pořadí zahájení expozice nebo v pořadí koncentrací, mohl by nějaký časově podmíněný efekt, např. únava obsluhy nebo jiné pochybení, vést k vyšším účinkům při vyšších koncentracích. Mohou-li být dále výsledky ovlivněny počátečními podmínkami zkoušky nebo okolními podmínkami, jako je např. umístění v laboratoři, mělo by být zváženo blokové uspořádání zkoušky.

XX.1.8 POSTUP

XX.1.8.1 Podmínky expozice

XX.1.8.1.1 Délka expozice
Zkouška trvá 21 dní.

XX.1.8.1.2 Nasazování
Matečné organismy se umístí po jednom do zkušebních nádob s 50 až 100 ml média.
Aby bylo možné splnit požadavky analytické metody použité pro stanovení koncentrace zkoušené látky, může být v některých případech nezbytné použít větší objemy, přípustné je rovněž sdružování paralelních vzorků k chemické analýze. Jsou-li použity objemy větší než 100 ml, může být nezbytné zvýšit krmné dávky podávané dafniím, aby se zajistila odpovídající dostupnost stravy a splnila kritéria validity. U průtokových zkoušek mohou být z technických důvodů zvážena jiná uspořádání (např. čtyři skupiny po 10 organismech ve větším zkušebním objemu), avšak jakékoli změny uspořádání zkoušky musí být ale uvedeny v závěrečné zprávě.

XX.1.8.1.3 Počet organismů
U semistatických zkoušek se nasadí jednotlivě alespoň 10 organismů pro každou zkušební koncentraci a alespoň 10 organismů jednotlivě do zkušebních skupin.
U průtokových zkoušek se ukázalo vhodným rozdělit pro každou koncentraci 40 organismů do čtyř skupin po 10 organismech (1). Může být použit menší počet zkušebních organismů, přičemž se doporučuje na jednu koncentraci rozdělit minimálně 20 organismů do dvou nebo více paralelních skupin o stejném počtu organismů (např. čtyři paralelní skupiny po pěti dafniích). Je třeba poznamenat, že u zkoušek, při níž se organismy nasazují jako skupiny, nebude možné vyjádřit reprodukční schopnost jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky v případě, že matečný organismus uhyne. V takovém případě se reprodukční schopnost vyjádří jako „celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu přítomného na začátku zkoušky“.

XX.1.8.1.4 Krmení
U semistatických zkoušek se dafnie krmí nejlépe denně, alespoň však třikrát týdně (tj. s výměnou média). Odchylky od této praxe (např. u průtokových zkoušek) se uvedou ve zprávě.
Strava matečných organismů během zkoušky by měla sestávat nejlépe z živých buněk řas jednoho nebo více následujících druhů: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nyní Pseudokirchneriella subcapitata (11)) a Scenedesmus subspicatus. Množství dodávané stravy by mělo vycházet z množství organického uhlíku (C) dodávaného na jeden matečný organismus. Výzkum (12) ukázal, že u druhu Daphnia magna je postačující pro dosažení dostatečného potomstva nezbytného pro splnění kritérií validity množství stravy od 0,1 do 0,2 mg C na dafnii za den. Strava může být dodávána buď ve stejných dávkách po celou dobu zkoušky, nebo podle požadavku v nižších dávkách na začátku zkoušky a poté ve zvyšujících se dávkách s ohledem na růst matečných organismů. V takovém případě by mělo množství stravy po celou dobu zůstat v doporučeném rozmezí 0,1 až 0,2 mg C na dafnii za den.
Použije-li se k určení potřebného množství stravy zástupný ukazatel, jako je počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle, musí každá laboratoř vytvořit vlastní nomogram vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultuře řas (viz dodatek 2 s návodem na vytvoření nomogramu). Nomogramy by měly být ověřovány jednou ročně a častěji v případě, že se změní podmínky kultivace řas. Absorbance ve viditelném světle byla shledána lepším zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku, než počet buněk (13).
Dafniím by měla být dodávána koncentrovaná suspenze řas, aby se minimalizoval objem kultivačního média řas uváděný do zkušební nádoby. Zkoncentrování řas lze dosáhnout centrifugací a následnou resuspenzí v destilované vodě, v deionisované vodě nebo v kultivačním médiu dafnií.

XX.1.8.1.5 Osvětlení
16 hodin světla při intenzitě nepřekračující 15 až 20 µE m^-2·s^-1.

XX.1.8.1.6 Teplota
Teplota zkušebního média by se měla pohybovat v rozmezí 18 až 22 °C. V žádné zkoušce by však teplota neměla v těchto mezích kolísat o více než 2 °C (např. 18 až 20, 19 až 21 nebo 20 až 22 °C). Pro účely sledování teploty může být vhodné použít další zkušební nádobu.

XX.1.8.1.7 Provzdušňování
Zkušební nádoby nesmí být v průběhu zkoušky provzdušňovány.

XX.1.8.2 Zkušební koncentrace
Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2 a přiměřený počet paralelních zkušebních skupin v rámci každé zkušební koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušebním médiu.
Při volbě rozsahu koncentrací by měly být zohledněny následující zásady:
i) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejnižší zkušební koncentrace dostatečně nízká, aby nebyla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se sníženou nejnižší koncentrací;
ii) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyšší zkušební koncentrace dostatečně vysoká, aby byla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se zvýšenou nejvyšší koncentrací;
iii) má-li být pro účinky na reprodukci odhadnuta EC_x, doporučuje se, aby byl použit dostatečný počet koncentrací s cílem zjistit EC_x s přijatelným intervalem spolehlivosti. Je-li znám odhad EC₅₀ pro účinky na reprodukci, doporučuje se, aby byla nejvyšší zkušební koncentrace vyšší než tato EC₅₀. Jinak sice bude stále možné odhadnout EC₅₀, interval spolehlivosti však bude velmi široký a nemusí být možné uspokojivé posouzení přiměřenosti navrženého modelu;
iv) do rozsahu zkušebních koncentrací by nejlépe neměly spadat koncentrace, které mají statisticky významný účinek na přežití dospělců, neboť by mohl být změněn charakter zkoušky z pouhé zkoušky toxicity pro reprodukci na kombinovanou zkoušku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje daleko složitější statistickou analýzu.
Předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií) by měla pomoci při volbě vhodných zkušebních koncentrací.
Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku rozpouštědlo nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádobě vyšší než 0,1 ml·l^-1 a měla by být ve všech zkušebních nádobách stejná.

XX.1.8.3 Kontrolní skupiny
Kromě zkušební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkušebního média a podle potřeby jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouštědlo nebo dispergátor. Použije-li se rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být jejich koncentrace stejná jako koncentrace v nádobách se zkoušenou látkou. Použije se vhodný počet paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3).
V dobře vedených zkouškách by měl být variační koeficient středního počtu živých potomků narozených každému matečnému organismu v kontrolní skupině (kontrolních skupinách) zpravidla ≤ 25 %, a to by mělo být uvedeno v plánu zkoušek s oddělenými jedinci.

XX.1.8.4 Obnovování zkušebního média
Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, médium se však obnovuje alespoň třikrát týdně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po tři dny) stálá (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měl by být zváženo častější obnovování média nebo průtoková zkouška.
Při obnovování média v semistatických zkouškách se připraví druhá série zkušebních nádob a matečné organismy se do nich přenesou např. skleněnou pipetou o vhodném průměru. Objem média přeneseného s dafniemi by měl být co nejmenší.

XX.1.8.5 Pozorování
Výsledky pozorování prováděných během zkoušky se zaznamenávají do přehledu dat (viz příklady v dodatcích 3 a 4). Jsou-li požadována další měření (viz body 1.3 a 1.8.8), může být nezbytné provádět další pozorování.

XX.1.8.6 Potomstvo
Potomstvo pocházející z každého matečného organismu se od jeho prvního výskytu nejlépe denně vybírá a počítá, aby nespotřebovávalo potravu určenou pro dospělého jedince. Pro účely této metody je třeba započítat pouze živé potomstvo, avšak zaznamenává se i přítomnost potracených vajíček nebo mrtvého potomstva.

XX.1.8.7 Mortalita
Mortalita matečných organismů se zaznamenává nejlépe denně, alespoň současně s počítáním potomstva.

XX.1.8.8 Další parametry
Třebaže je tato metoda navržena hlavně k posouzení účinků na reprodukci, je možné, aby byly v míře dostatečné pro statistickou analýzu kvantifikovány i jiné účinky. Užitečné je zvláště měření růstu, neboť poskytuje informaci o možných subletálních účincích. Tato pozorování mohou být užitečnější než samotné měření reprodukce. Doporučuje se změřit na konci zkoušky délku matečných organismů (tj. délku těla bez zadečkového hrotu). K parametrům, které lze měřit nebo vypočítávat patří dále doba do narození prvních plůdků (a následně dalších potomků), počet a velikost potomků na jeden organismus, počet potracených plůdků, přítomnost jedinců samčího pohlaví nebo efipií a imanentní růst populace.

XX.1.8.9 Častost analytických stanovení a měření
Alespoň jednou týdně se měří koncentrace kyslíku, teplota, tvrdost a pH v čerstvém a ve starém médiu, v kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace.
Během zkoušky se v pravidelných intervalech stanoví koncentrace zkoušené látky stanovují
U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ±20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 % – viz body 1.4 a 1.4.8), se doporučuje analyzovat alespoň nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a při obnovování, a to jednou během prvního týdne zkoušky (tj. analýzy se provedou na vzorku z téhož roztoku – při jeho přípravě a při obnovování). Tato stanovení se poté opakují alespoň v týdenních intervalech.
U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to ihned po jejich přípravě a při obnovování. U zkoušek, u nichž není naměřená počáteční koncentrace zkoušené látky v rozsahu ±20 % nominální koncentrace, avšak u nichž lze dostatečně prokázat, že počáteční koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé, (tj. od 80 do 120 % počátečních koncentrací), by mohla být stanovení ve 2. a 3. týdnu zkoušky omezena na nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace. Ve všech případech je stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádoby.
U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Doporučuje se však zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé. V těchto typech zkoušky se průtok ředicí vody a zkoušené látky kontroluje denně.
Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ±20 %, vyjádří se výsledky jako časově vážené průměry (viz dodatek 5).

XX.2 DATA A ZPRÁVY

XX.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Účelem této zkoušky je stanovit účinek zkoušené látky na celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. Celkový počet potomků na matečný organismus se vypočte pro každou zkušební nádobu (tj. pro každou paralelní nádobu). Jestliže v kterékoli paralelní nádobě matečný organismus během zkoušky uhyne nebo se zjistí, že jde o samečka, vyloučí se nádoba z experimentu. Analýza se poté provede se zmenšeným počtem paralelních nádob.
Pro odhad LOEC a tedy i NOEC vztahujících se k účinkům chemické látky na reprodukční schopnosti je nezbytné vypočíst střední hodnotu reprodukční schopnosti přes všechny paralelní nádoby pro každou koncentraci a spojený residuální rozptyl, a to lze provést analýzou rozptylu (ANOVA). Střední hodnota pro každou koncentraci musí být poté porovnána se střední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou mnohonásobného porovnání. Užitečnými mohou být Dunnettův nebo Williamsův test (14, 15, 16, 17). Je nezbytné ověřit, že je splněn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Doporučuje se provést ověření raději graficky než formálním testem významnosti (18); vhodnou alternativou je Bartlettův test. Není-li tento předpoklad splněn, měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylu, nebo by měla být provedena vážená ANOVA. Vypočte a uvede se velikost účinku zjistitelná pomocí ANOVA (tj. nejmenší významný rozdíl).
Pro odhad koncentrace, která způsobuje 50% snížení reprodukční schopnosti (tj. EC₅₀), se daty proloží vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka by měla být tak parametrizována, aby bylo možné přímo odhadnout EC₅₀ a její směrodatnou odchylku. To značně usnadní výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnotu EC₅₀. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. To lze provést graficky nebo rozdělením residuálního součtu čtverců na složku „chyby v proložení“ a „náhodné chyby“ a provedením testu významnosti chyby v proložení. Vzhledem k tomu, že u expozic, jejichž důsledkem je vyšší reprodukční schopnost, je větší rozptyl počtu vylíhnutých potomků než u expozic vedoucích k nejnižší reprodukční schopnosti, je třeba promyslet vážení pozorovaných hodnot s cílem zohlednit různé rozptyly u různě exponovaných skupin (viz výchozí informace (18)).
Při analýze dat z rozhodujícího okružního testu (2) byl použit následující model prokládající logaritmickou křivku; lze však použít i jiné modely:
$Y=\frac{c}{1+\frac{x^b}{x_0}}$
kde:
Y: celkový počet živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (vypočteno pro každou nádobu)
x: koncentrace látky
c: očekávaný počet potomků při x = 0
x₀: EC₅₀ v populaci
b: směrnice.
Tento model bude pravděpodobně vhodný pro velký počet situací, budou však existovat zkoušky, pro něž bude nevhodný. Jak je uvedeno výše, je třeba ověřit validitu modelu. V některých případech může být vhodnější model předpokládající rozmezí, u něhož vedou nižší koncentrace k pozitivním účinkům (19).
Lze rovněž odhadnout další koncentrace s určitým účinkem, např. EC₁₀ nebo EC₂₀, může být však dobré použít jinou parametrizaci modelu, než je použita pro odhad EC₅₀.

XX.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XX.2.2.1 Zkoušená látka:
— fyzikální povaha a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
— údaje o chemické identitě včetně údaje o čistotě.

XX.2.2.2 Testovací druhy:
— klon (byl-li geneticky popsán), dodavatel nebo zdroj (je-li znám) a použité kultivační podmínky. Byl-li použit jiný druh než Daphnia magna, musí to být uvedeno a zdůvodněno.

XX.2.2.3 Zkušební podmínky:
— použitý zkušební postup (např. semistatická nebo průtoková metoda, objem, velikost obsádky v počtu dafnií na litr),
— fotoperioda a intenzita světla,
— uspořádání zkoušky (např. počet paralelních nádob, počet matečných organismů na jednu paralelní nádobu),
— podrobnosti o použitém kultivačním médiu,
— byly-li použity, přídavky organických látek včetně jejich složení, zdroje, metody přípravy, TOC/CHSK výchozích preparátů, odhad výsledného TOC/CHSK ve zkušebním médiu,
— podrobné informace o krmení, včetně množství (v mg C na dafnii za den) a plánu (např. typ krmiva, včetně specifického názvu (druhu) u řas a kmene, je-li znám, kultivační podmínky),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jsou-li použity, uvedou se rozpouštědlo nebo dispergátor a jejich koncentrace),

XX.2.2.4 Výsledky:
— výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,
— nominální zkušební koncentrace a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 4); uvede se také výtěžek metody a mez stanovitelnosti,
— kvalita vody ve zkušebních nádobách (tj. pH, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku a TOC a/nebo CHSK a dále podle potřeby tvrdost) (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
— celkový počet živých potomků na každý matečný organismus (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
— počet uhynulých matečných organismů a den, kdy k úhynu došlo (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
— variační koeficient kontrolní reprodukční schopnosti (založený na celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky),
— křivka závislosti celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (pro každou paralelní nádobu), na koncentraci zkoušené látky
— nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na reprodukci včetně popisu použitých statistických metod a údaje o velikosti účinku, který by mohl být detekován, a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) na reprodukci; je-li k dispozici, uvede se LOEC/NOEC pro mortalitu matečných organismů,
— je-li k dispozici, EC_x pro reprodukci a interval spolehlivosti, dále graf křivky modelu použitého pro její výpočet, směrnice křivky závislosti dávka-reakce a její směrodatná odchylka,
— jiné pozorované biologické účinky a jiná měření: uvedou se jakékoli jiné biologické účinky, které byly pozorovány nebo změřeny (např. růst matečných organismů) včetně přiměřeného zdůvodnění,
— vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.

XX.3 LITERATURA

(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20. – 21. březen 1993.

(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring. Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paříž 1997.

(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M., Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicol Environ. Safety, 21, str. 257 – 265.

(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25 – 33.

(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.

(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol, 47, str. 775 – 782.

(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 str.

(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C., Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H. Tyle &amp; F. Bro-Rasmussen. Eds.), str. 144 – 148.

(9) Parkhurst B. R., Forte J. L., Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 26, str. 1 – 8.

(10) Cowgill U. M., Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), str. 185 –196.

(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.

(12) Sims I. R., Watson S., Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. Chem., 12, str. 2053 – 2058.

(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, str. 459 – 466.

(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096 – 1121.

(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, str. 482 – 491.

(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, str. 103 – 117.

(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, str. 510 – 531.

(18) Draper N. R., Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.

(19) Brain P., Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, str. 93 – 96.

(20) Wilson E. O., Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.

(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, str. 532.

(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L., Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, str. 1156 – 1166.