XX.1.8 POSTUP
XX.1.8.1 Podmínky expozice
XX.1.8.1.1 Délka expozice
Zkouška trvá 21 dní.
XX.1.8.1.2 Nasazování
Matečné organismy se umístí po jednom do zkušebních nádob s 50 až 100 ml média.
Aby bylo možné splnit požadavky analytické metody použité pro stanovení koncentrace zkoušené látky, může být v některých případech nezbytné použít větší objemy, přípustné je rovněž sdružování paralelních vzorků k chemické analýze. Jsou-li použity objemy větší než 100 ml, může být nezbytné zvýšit krmné dávky podávané dafniím, aby se zajistila odpovídající dostupnost stravy a splnila kritéria validity. U průtokových zkoušek mohou být z technických důvodů zvážena jiná uspořádání (např. čtyři skupiny po 10 organismech ve větším zkušebním objemu), avšak jakékoli změny uspořádání zkoušky musí být ale uvedeny v závěrečné zprávě.
XX.1.8.1.3 Počet organismů
U semistatických zkoušek se nasadí jednotlivě alespoň 10 organismů pro každou zkušební koncentraci a alespoň 10 organismů jednotlivě do zkušebních skupin.
U průtokových zkoušek se ukázalo vhodným rozdělit pro každou koncentraci 40 organismů do čtyř skupin po 10 organismech (1). Může být použit menší počet zkušebních organismů, přičemž se doporučuje na jednu koncentraci rozdělit minimálně 20 organismů do dvou nebo více paralelních skupin o stejném počtu organismů (např. čtyři paralelní skupiny po pěti dafniích). Je třeba poznamenat, že u zkoušek, při níž se organismy nasazují jako skupiny, nebude možné vyjádřit reprodukční schopnost jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky v případě, že matečný organismus uhyne. V takovém případě se reprodukční schopnost vyjádří jako „celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu přítomného na začátku zkoušky“.
XX.1.8.1.4 Krmení
U semistatických zkoušek se dafnie krmí nejlépe denně, alespoň však třikrát týdně (tj. s výměnou média). Odchylky od této praxe (např. u průtokových zkoušek) se uvedou ve zprávě.
Strava matečných organismů během zkoušky by měla sestávat nejlépe z živých buněk řas jednoho nebo více následujících druhů: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nyní Pseudokirchneriella subcapitata (11)) a Scenedesmus subspicatus. Množství dodávané stravy by mělo vycházet z množství organického uhlíku (C) dodávaného na jeden matečný organismus. Výzkum (12) ukázal, že u druhu Daphnia magna je postačující pro dosažení dostatečného potomstva nezbytného pro splnění kritérií validity množství stravy od 0,1 do 0,2 mg C na dafnii za den. Strava může být dodávána buď ve stejných dávkách po celou dobu zkoušky, nebo podle požadavku v nižších dávkách na začátku zkoušky a poté ve zvyšujících se dávkách s ohledem na růst matečných organismů. V takovém případě by mělo množství stravy po celou dobu zůstat v doporučeném rozmezí 0,1 až 0,2 mg C na dafnii za den.
Použije-li se k určení potřebného množství stravy zástupný ukazatel, jako je počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle, musí každá laboratoř vytvořit vlastní nomogram vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultuře řas (viz dodatek 2 s návodem na vytvoření nomogramu). Nomogramy by měly být ověřovány jednou ročně a častěji v případě, že se změní podmínky kultivace řas. Absorbance ve viditelném světle byla shledána lepším zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku, než počet buněk (13).
Dafniím by měla být dodávána koncentrovaná suspenze řas, aby se minimalizoval objem kultivačního média řas uváděný do zkušební nádoby. Zkoncentrování řas lze dosáhnout centrifugací a následnou resuspenzí v destilované vodě, v deionisované vodě nebo v kultivačním médiu dafnií.
XX.1.8.1.5 Osvětlení
16 hodin světla při intenzitě nepřekračující 15 až 20 µE m-2·s-1.
XX.1.8.1.6 Teplota
Teplota zkušebního média by se měla pohybovat v rozmezí 18 až 22 °C. V žádné zkoušce by však teplota neměla v těchto mezích kolísat o více než 2 °C (např. 18 až 20, 19 až 21 nebo 20 až 22 °C). Pro účely sledování teploty může být vhodné použít další zkušební nádobu.
XX.1.8.1.7 Provzdušňování
Zkušební nádoby nesmí být v průběhu zkoušky provzdušňovány.
XX.1.8.2 Zkušební koncentrace
Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2 a přiměřený počet paralelních zkušebních skupin v rámci každé zkušební koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušebním médiu.
Při volbě rozsahu koncentrací by měly být zohledněny následující zásady:
i) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejnižší zkušební koncentrace dostatečně nízká, aby nebyla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se sníženou nejnižší koncentrací;
ii) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyšší zkušební koncentrace dostatečně vysoká, aby byla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se zvýšenou nejvyšší koncentrací;
iii) má-li být pro účinky na reprodukci odhadnuta ECx, doporučuje se, aby byl použit dostatečný počet koncentrací s cílem zjistit ECx s přijatelným intervalem spolehlivosti. Je-li znám odhad EC50 pro účinky na reprodukci, doporučuje se, aby byla nejvyšší zkušební koncentrace vyšší než tato EC50. Jinak sice bude stále možné odhadnout EC50, interval spolehlivosti však bude velmi široký a nemusí být možné uspokojivé posouzení přiměřenosti navrženého modelu;
iv) do rozsahu zkušebních koncentrací by nejlépe neměly spadat koncentrace, které mají statisticky významný účinek na přežití dospělců, neboť by mohl být změněn charakter zkoušky z pouhé zkoušky toxicity pro reprodukci na kombinovanou zkoušku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje daleko složitější statistickou analýzu.
Předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií) by měla pomoci při volbě vhodných zkušebních koncentrací.
Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku rozpouštědlo nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádobě vyšší než 0,1 ml·l-1 a měla by být ve všech zkušebních nádobách stejná.
XX.1.8.3 Kontrolní skupiny
Kromě zkušební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkušebního média a podle potřeby jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouštědlo nebo dispergátor. Použije-li se rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být jejich koncentrace stejná jako koncentrace v nádobách se zkoušenou látkou. Použije se vhodný počet paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3).
V dobře vedených zkouškách by měl být variační koeficient středního počtu živých potomků narozených každému matečnému organismu v kontrolní skupině (kontrolních skupinách) zpravidla ≤ 25 %, a to by mělo být uvedeno v plánu zkoušek s oddělenými jedinci.
XX.1.8.4 Obnovování zkušebního média
Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, médium se však obnovuje alespoň třikrát týdně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po tři dny) stálá (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měl by být zváženo častější obnovování média nebo průtoková zkouška.
Při obnovování média v semistatických zkouškách se připraví druhá série zkušebních nádob a matečné organismy se do nich přenesou např. skleněnou pipetou o vhodném průměru. Objem média přeneseného s dafniemi by měl být co nejmenší.
XX.1.8.5 Pozorování
Výsledky pozorování prováděných během zkoušky se zaznamenávají do přehledu dat (viz příklady v dodatcích 3 a 4). Jsou-li požadována další měření (viz body 1.3 a 1.8.8), může být nezbytné provádět další pozorování.
XX.1.8.6 Potomstvo
Potomstvo pocházející z každého matečného organismu se od jeho prvního výskytu nejlépe denně vybírá a počítá, aby nespotřebovávalo potravu určenou pro dospělého jedince. Pro účely této metody je třeba započítat pouze živé potomstvo, avšak zaznamenává se i přítomnost potracených vajíček nebo mrtvého potomstva.
XX.1.8.7 Mortalita
Mortalita matečných organismů se zaznamenává nejlépe denně, alespoň současně s počítáním potomstva.
XX.1.8.8 Další parametry
Třebaže je tato metoda navržena hlavně k posouzení účinků na reprodukci, je možné, aby byly v míře dostatečné pro statistickou analýzu kvantifikovány i jiné účinky. Užitečné je zvláště měření růstu, neboť poskytuje informaci o možných subletálních účincích. Tato pozorování mohou být užitečnější než samotné měření reprodukce. Doporučuje se změřit na konci zkoušky délku matečných organismů (tj. délku těla bez zadečkového hrotu). K parametrům, které lze měřit nebo vypočítávat patří dále doba do narození prvních plůdků (a následně dalších potomků), počet a velikost potomků na jeden organismus, počet potracených plůdků, přítomnost jedinců samčího pohlaví nebo efipií a imanentní růst populace.
XX.1.8.9 Častost analytických stanovení a měření
Alespoň jednou týdně se měří koncentrace kyslíku, teplota, tvrdost a pH v čerstvém a ve starém médiu, v kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace.
Během zkoušky se v pravidelných intervalech stanoví koncentrace zkoušené látky stanovují
U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ±20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 % – viz body 1.4 a 1.4.8), se doporučuje analyzovat alespoň nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a při obnovování, a to jednou během prvního týdne zkoušky (tj. analýzy se provedou na vzorku z téhož roztoku – při jeho přípravě a při obnovování). Tato stanovení se poté opakují alespoň v týdenních intervalech.
U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to ihned po jejich přípravě a při obnovování. U zkoušek, u nichž není naměřená počáteční koncentrace zkoušené látky v rozsahu ±20 % nominální koncentrace, avšak u nichž lze dostatečně prokázat, že počáteční koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé, (tj. od 80 do 120 % počátečních koncentrací), by mohla být stanovení ve 2. a 3. týdnu zkoušky omezena na nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace. Ve všech případech je stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádoby.
U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Doporučuje se však zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé. V těchto typech zkoušky se průtok ředicí vody a zkoušené látky kontroluje denně.
Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než ±20 %, vyjádří se výsledky jako časově vážené průměry (viz dodatek 5).