XXIII. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE CHEMICKÉ LÁTKY V PŮDĚ
(metoda C.23 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)
DODATEK 1
TLAK VODY, POLNÍ KAPACITA (PK) A RETENČNÍ VODNÍ KAPACITA (RVK)

Výška vodního sloupce [cm]	pFa	barb	Poznámky
107	7	104	Suchá půda
1,6ˑ104	4,2	16	Bod vadnutí
104	4	10
103	3	1
6ˑ102	2,8	0,6
3,3ˑ102	2,5	0,33c
102 60 33	2 1,8 1,5	0,1 0,06 } 0,033	Rozpětí polní kapacityd
10	1	0,01	RVK (přibližná hodnota)
1	0	0,001	Půda nasycená vodou

^a pF = dekadický logaritmus výšky vodního sloupce v cm.
^b 1 bar = 10⁵ Pa.
^c Odpovídá přibližnému obsahu vody při složení 10 % písku, 35 % hlíny a 45 % jílu.
^d Polní kapacita není konstanta, ale mění se v závislosti na druhu půdy od pF 1,5 do 2,5.
Tlak vody se vyjadřuje v cm vodního sloupce nebo v jednotkách bar. Vzhledem k velkému rozpětí se sací tlak vyjadřuje jednoduše jako hodnota pF, která je ekvivalentní logaritmu vodního sloupce v cm.
Polní kapacita je definována jako množství vody, které přírodní půda po delším deštivém období nebo po dostatečném zavlažení udrží proti gravitaci 2 dny. Stanovuje se u neporušené půdy v polním pokusu. Naměřená hodnota tedy není použitelná pro laboratorní vzorky porušené půdy. Hodnoty PK stanovené u porušených půd mohou vykazovat větší systematické odchylky.
Retenční vodní kapacita (RVK) se stanovuje v laboratoři u neporušené i porušené půdy tak, že se kapilárním vzlínáním nasytí sloupec půdy vodou. Využije se zejména u porušených půd, kdy může být RVK až o 30 % vyšší než polní kapacita (1). Také se stanovuje snadněji než spolehlivé hodnoty PK.
DODATEK 2
VLHKOST PŮDY (v g vody na 100 g sušiny) U RŮZNÝCH DRUHŮ PŮD Z RŮZNÝCH ZEMÍ

Druh půdy	Země	Vlhkost půdy při
		RVK1	pF = 1,8	pF = 2,5
Písčitá	Německo	28,7	8,8	3,9
Hlinitopísčitá	Německo	50,4	17,9	12,1
Hlinitopísčitá	Švýcarsko	44,0	35,3	9,2
Prachovitohlinitá	Švýcarsko	72,8	56,6	28,4
Jílovitohlinitá	Brazílie	69,7	38,4	27,3
Jílovitohlinitá	Japonsko	74,4	57,8	31,4
Písčitohlinitá	Japonsko	82,4	59,2	36,0
Prachovitohlinitá	USA	47,2	33,2	18,8
Písčitohlinitá	USA	40,4	25,2	13,3
1 Retenční vodní kapacita

DODATEK 3
Obrázek 1
Příklad průtokové aparatury pro studium transformace chemických látek v půdě (viz literatura 1 a 2)

1:	jehlový ventil	4:	baňka pro studium metabolismu v půdě (zalitá vodou pouze v případě anaerobních podmínek a podmínek rýžového pole)	7, 8:	zátka z hydroxidu sodného pro zachycení CO2 a jiných kyselých těkavých látek
2:	promývačka s vodou	5:	baňka s ethylenglykolem pro zachycení organických těkavých sloučenin	9:	průtokoměr
3:	ultramembrána (pouze ve sterilních podmínkách), velikost pórů 0,2 μm	6:	baňka s kyselinou sírovou pro zachycení alkalických těkavých sloučenin

Obrázek 2
Příklad biometrické baňky pro studium transformace chemických látek v půdě (viz literatura 3)

(1) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In: Interactions between Herbicides and the Soil. Vyd. R. J. Hance, Academic Press, 123 – 157.

(2) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D.H. Hutson, T.R. Roberts, J. Wiley & Sons. Vol 1, 85 – 114.

(3) Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141 – 146.

XXIII.1. METODA
Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 307 (2002).

XXIII.1.1 ÚVOD
Postup popsaný v této zkušební metodě je vyvinut pro účely hodnocení aerobní a anaerobní transformace chemické látky v půdě. Je založen na doporučeních a směrnicích národních a mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 9). Účelem experimentů je stanovit i) rychlost transformace zkoušené látky a ii) povahu a rychlost tvorby a rozkladu transformačních produktů, kterým mohou být rostliny a půdní organismy vystaveny. Tyto studie jsou požadovány u chemických látek, které se aplikují přímo do půdy nebo pravděpodobně mohou proniknout do půdního ekosystému. Výsledky těchto laboratorních studií mohou být také použity pro vypracování postupů odběru vzorků a analýzy u podobných polních studií.
Pro vyhodnocení způsobu transformace obvykle postačují aerobní a anaerobní studie s jedním druhem půdy (viz literatura 8, 10 a 11). Rychlosti transformace se stanoví alespoň pro tři další půdy (viz literatura 8 a 10).
Druhy zkušebních půd by měly být reprezentativní pro environmentální podmínky, v nichž dojde k použití látky nebo k jejímu uvolnění. Například chemické látky, k jejichž uvolnění může dojít v subtropickém až tropickém klimatu, by měly být zkoušeny s ferrasoly nebo nitosoly (systém FAO). Tato metoda se rovněž týká půd rýžových polí.

XXIII.1.2 DEFINICE
Zkoušená látka: jakákoli látka, ať již výchozí látka, nebo příslušné transformační produkty.
Transformační produkty: všechny látky vznikající při biotických a abiotických transformačních reakcích zkoušené látky, včetně CO₂ a látek, které jsou přítomny ve vázaných reziduích.
Vázaná rezidua: sloučeniny v půdě, rostlině nebo v živočichu, které po extrakci zůstávají v matrici ve formě výchozí látky nebo (jejího metabolitu (jejích metabolitů) nebo transformačních produktů. Metoda extrakce nesmí podstatně měnit samotné sloučeniny nebo strukturu matrice. Povahu vazeb lze částečně vyjasnit extrakcí spojenou se změnami v matrici a náročnými analytickými technikami. Dosud byly tímto způsobem vyjasněny např. kovalentní, iontové a adsorpční vazby a rovněž záchyty. Tvorba vázaných reziduí obecně podstatně snižuje biologickou přístupnost a dostupnost (viz literatura 12) [upraveno podle IUPAC 1984 (viz literatura 13)].
Aerobní transformace: reakce, ke kterým dochází za přítomnosti kyslíku (viz literatura 14).
Anaerobní transformace: reakce probíhající s vyloučením molekulárního kyslíku (viz literatura 14).
Půda: směs minerálních a organických chemických složek oživená malými organismy (většinou mikroorganismy), přičemž organické složky obsahují sloučeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Lze pracovat s dvěma formami půdy:
Mineralizace: úplný rozklad organické sloučeniny na CO₂, H₂O za aerobních podmínek a na CH₄, CO₂ a H₂O za anaerobních podmínek. V souvislosti s touto metodou, při níž se používají sloučeniny značené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad molekuly, při němž se radioisotopy uhlíku oxidují za tvorby odpovídajícího množství ¹⁴CO₂ (viz literatura 14).
Poločas: t_0,5, je čas, za který dojde k 50% transformaci zkoušené látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního řádu; nezávisí na počáteční koncentraci.
DT₅₀ (doba odbourání 50): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 50 %; liší se od poločasu t_0,5, pokud transformace neprobíhá podle kinetiky prvního řádu.
DT₇₅ (doba odbourání 75): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 75 %.
DT₉₀ (doba odbourání 90): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 90 %.

a) s neporušenou půdou, jak v průběhu času vznikla, s charakteristickými vrstvami různých druhů půdy;

b) s porušenou půdou, která se obvykle vyskytuje na obdělávaných polích v případě, že se vzorky odebírají vyrýváním a používají se v této zkušební metodě (viz literatura 14).

XXIII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Referenční látky se použijí pro charakterizaci a/nebo identifikaci transformačních produktů spektroskopickými a chromatografickými metodami.

XXIII.1.4 POUŽITELNOST ZKOUŠKY
Tato je metoda je použitelná pro všechny chemické látky (neznačené nebo značené radioaktivními isotopy), pro něž je k dispozici analytická metoda s dostatečnou správností a citlivostí. Je použitelná pro mírně těkavé a netěkavé sloučeniny rozpustné i nerozpustné ve vodě. Zkouška by neměla být použita u látek, které z půdy silně těkají (např. fumiganty, organická rozpouštědla), a nelze je tedy v půdě udržet za experimentálních podmínek této zkoušky.

XXIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Pro stanovení rychlosti transformace lze použít jak látky neznačené radioisotopy, tak značené látky. Značený materiál je nezbytný pro studium způsobu transformace a pro stanovení látkové bilance. Doporučuje se značení isotopem ¹⁴C, avšak užitečné mohou být i jiné isotopy, např. ¹³C, ¹⁵N, ³H, ³²P. Značena by měla být pokud možno nejstabilnější část (nejstabilnější části) molekuly. Pokud například zkoušená látka obsahuje jeden aromatický kruh, je třeba, aby byl tento kruh označen. Pokud zkoušená látka obsahuje dva nebo více kruhů, může být nezbytné provést samostatné studie s cílem podchytit zbytky každého z kruhů, a získat tak vhodné informace o tvorbě transformačních produktů.). Čistota látky by měla být alespoň 95 %.
Před provedením zkoušky na aerobní a anaerobní transformaci v půdě by měly být k dispozici alespoň tyto informace o látce:
Mezi další užitečné informace patří údaje o toxicitě zkoušené látky pro půdní mikroorganismy [zkušební metody C.21 a C.22] (viz literatura 16).
K dispozici by měly být analytické metody (včetně extrakčních a izolačních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkoušené látky a jejích transformačních produktů.

a) rozpustnost ve vodě (metoda A.6)

b) rozpustnost v organických rozpouštědlech;

c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta;

d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8);

e) chemická stabilita v temnu (hydrolýza) (metoda C.7);

f) pK_a, pokud u molekuly nastává protonace nebo deprotonace [směrnice OECD 112] (viz literatura 16).

XXIII.1.6 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Vzorky půdy se exponují zkušební látce a inkubují se v temnu v biometrických baňkách nebo v průtokových systémech za řízených laboratorních podmínek (při konstantní teplotě a vlhkosti půdy). Ve vhodných intervalech se vzorky půd extrahují a analyzuje se obsah výchozí látky a transformačních produktů. Vhodným absorpčním zařízením se k analýze shromáždí také těkavé produkty. Prostřednictvím materiálu značeného isotopem ¹⁴C lze po zachycení uvolněného ¹⁴CO₂ měřit různé rychlosti mineralizace zkoušené látky a dále lze stanovit látkovou bilanci včetně tvorby vázaných reziduí v půdě.

XXIII.1.7 KRITÉRIA JAKOSTI

XXIII.1.7.1 Výtěžnost
Extrakce a analýza provedená alespoň u dvou duplikátních vzorků půdy ihned po přidání zkoušené látky poskytne první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnoměrnosti aplikace zkoušené látky. Výtěžnosti pozdějších stupňů experimentu se zjistí z příslušných látkových bilancí. Výtěžnosti by se měly nacházet v rozmezí 90 % až 110 % u značených chemických látek (viz literatura 8) a v rozmezí 70 % až 110 % u neznačených chemických látek (viz literatura 3).

XXIII.1.7.2 Opakovatelnost a citlivost analytické metody
Opakovatelnost analytické metody (kromě účinnosti první extrakce) pro kvantitativní stanovení zkoušené látky a transformačních produktů lze ověřit provedením analýzy duplikátních vzorků týchž extraktů půdy, která byla dostatečně dlouho inkubována, aby došlo k vytvoření transformačních produktů.
Mez detekce (LOD) analytické metody pro zkoušenou látku a pro transformační produkty by měla být alespoň 0,01 mg na kg půdy (pro zkoušenou látku) nebo 1 % aplikované dávky, podle toho, která z hodnot je nižší. Rovněž by měla být specifikována mez kvantitativní stanovitelnosti (LOQ).

XXIII.1.7.3 Správnost dat o transformaci
Regresní analýza závislosti koncentrace zkoušené látky na čase poskytuje vhodné informace o spolehlivosti transformační křivky a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro poločasy (v případě zdánlivé kinetiky prvního řádu) nebo pro hodnoty DT₅₀, popřípadě hodnot DT₇₅ a DT₉₀.

XXIII.1.8 POPIS METODY

XXIII.1.8.1 Vybavení a chemická činidla
Inkubačními systémy jsou statické uzavřené systémy nebo vhodné průtokové systémy (viz literatura 7 a 17). Příklady vhodných průtokových inkubačních aparatur a biometrických baněk jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2. Oba typy inkubačních systémů mají své výhody a svá omezení (viz literatura 7 a 17).
Pro zkoušku je nezbytné standardní laboratorní vybavení, zejména:
— analytické přístroje, jako jsou GLC, HPLC, TLC, včetně vhodných detekčních systémů pro analýzu značených nebo neznačených látek nebo pro inverzní isotopovou zřeďovací metodu;
— přístroje pro identifikaci látek (např. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR atd.);
— kapalinový scintilační spektrometr;
— okysličovací zařízení pro spalování radioaktivního materiálu;
— odstředivka;
— extrakční aparatura (např. centrifugační zkumavky pro studenou extrakci a Soxhletův přístroj pro kontinuální extrakci s refluxem);
— zařízení pro zkoncentrování roztoků a extraktů (např. rotační odparka);
— vodní lázeň;
— mechanické míchací zařízení (např. hnětací zařízení, rotační mixér).
Použijí se např. tato chemická činidla:
— NaOH p.a, 2 M, nebo jiná vhodná zásada (např. KOH, ethanolamin);
— H₂SO₄ p.a., 0,05 M;
— ethylenglykol p.a.;
— tuhý absorpční materiál, např. natronové vápno, a polyurethanové zátky;
— organická rozpouštědla čistoty p.a., např. aceton, methanol atd.;
— kapalný scintilátor.

XXIII.1.8.2 Aplikace zkoušené látky
Za účelem aplikace zkoušené látky do půdy a jejího rozptýlení lze zkoušenou látku rozpustit ve vodě (v deionizované nebo destilované vodě) nebo lze v případě potřeby použít co nejmenší množství acetonu nebo jiných organických rozpouštědel (viz literatura 6), ve kterých je zkoušená látka dostatečně rozpustná a stabilní. Zvolené množství rozpouštědla však nesmí mít významný vliv na mikrobiální aktivitu půdy (viz oddíly 1.5 a 1.9.2 až 1.9.3). Rozpouštědla, která působí jako inhibitory mikrobiální aktivity, např. chloroform, dichloromethan a jiná halogenovaná rozpouštědla, nesmějí být použita.
Látku lze do půdy přidat také např. ve směsi s křemenným pískem (viz literatura 6) nebo ve formě malých dílčích vzorků zkušební půdy, které byly předem vysušeny na vzduchu a sterilizovány. Pokud se látka přidává pomocí rozpouštědla, mělo by být rozpouštědlo odpařeno ještě před tím, než jsou k původním nesterilním vzorkům půdy přidány obohacené dílčí vzorky.
U běžně používaných chemických látek, jež se dostávají do půdy prostřednictvím zemědělské aplikace kalů z čistíren odpadních vod, se zkoušená látka nejprve přidá do kalu, který se poté vpraví do vzorku půdy (viz oddíly 1.9.2 a 1.9.3).
Nedoporučuje se používat rutinně přípravky v komerční úpravě. Například u špatně rozpustných látek však může být použití přípravku v komerční úpravě vhodnou alternativou.

XXIII.1.8.3 Půdy

XXIII.1.8.3.1 Výběr půd
Pro stanovení způsobu transformace lze použít reprezentativní půdy; doporučují se písčitohlinitá, prachovitohlinitá, hlinitá nebo hlinitopísčitá půda [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)] o hodnotě pH 5,5 až 8,0 a obsahu organického uhlíku 0,5 – 2,5 %, přičemž mikrobiální biomasa by měla tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku (viz literatura 10).
Pro studie transformačních rychlostí se použijí alespoň tři další půdy reprezentující rozsah relevantních půd. Půdy by se měly lišit, pokud jde o obsah organického uhlíku, pH, obsah jílu a mikrobiální biomasy (viz literatura 10).
U všech půd by měly být charakterizovány alespoň jejich: struktura (% písku, % prachu, % jílu) [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)], pH, kationtová výměnná kapacita, organický uhlík, sypná hustota, schopnost zadržet vodu a mikrobiální biomasa (pouze pro aerobní studie). Schopnost půdy zadržet vodu lze měřit jako polní kapacitu, jako retenční vodní kapacitu nebo jako vodní sací tlak (pF). Vysvětlení je uvedeno v dodatku 1. V protokolu o zkoušce by mělo být uvedeno, zda byly schopnost půdy zadržet vodu a sypná hustota stanoveny u neporušených polních vzorků, nebo porušených (zpracovaných) vzorků. Pro interpretaci výsledků mohou být užitečné další informace o vlastnostech půdy. Pro stanovení charakteristik půdy lze použít metody doporučené v literatuře (viz literatura 19 až 23). Mikrobiální biomasa se stanoví metodou respirace indukované substrátem (SIR) (viz literatura 25 a 26) nebo alternativními metodami (viz literatura 20).

XXIII.1.8.3.2 Odběr, příprava a skladování půd
K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Těmito informacemi jsou přesná poloha, vegetační kryt, údaje o ošetřování chemickými látkami, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo jiná kontaminace. Pokud byla půda v předchozích čtyřech letech ošetřena zkoušenou látkou nebo látkami s analogickou strukturou, neměla by být použita pro transformační studie (viz literatura 10 a 15).
Půda by měla být čerstvě odebraná z terénu (z A horizontu nebo z horní 20cm vrstvy) a měla by být tak vlhká, aby bylo možné snadné prosévání. Kromě půd z rýžových polí by půdy neměly být odebírány v průběhu dlouhých období (více než 30 dnů) sucha, mrazů nebo zavodnění nebo krátce po těchto obdobích (viz literatura 14). Vzorky se přepravují způsobem, který minimalizuje změny obsahu vody v půdě, a uchovávají se v temnu za co největšího přístupu vzduchu. Pro tento účel je obecně vhodný volně uzavřený polyethylenový sáček.
Půda se zpracuje co nejdříve po odběru. Před proséváním na sítu o velikosti 2 mm, při němž se odstraní malé kameny, drobní živočichové a zbytky rostlin, se z půdy odstraní vegetace, větší živočichové a kameny. Před proséváním by nemělo dojít k nadměrnému vysušení a rozdrcení půdy (viz literatura 15).
Pokud je v zimě obtížné odebrat vzorky v terénu (zmrzlá půda, sněhová pokrývka), mohou být odebrány z půdy skladované ve skleníku pod vegetačním pokryvem (např. zatravněné půdy nebo půdy s travní směsí s jetelem). V každém případě se upřednostňují studie s čerstvě odebranými půdami; pokud má být odebraná a zpracovaná půda před zahájením studie skladována, musí být skladována za odpovídajících podmínek a pouze po omezenou dobu (při (4 ± 2) °C po dobu maximálně tří měsíců), aby byla zachována mikrobiální aktivita. Z výsledků nedávných výzkumů vyplývá, že půdy z mírného pásma lze skladovat při -20 °C déle než tři měsíce (viz literatura 28 a 29), aniž dojde k významné ztrátě mikrobiální aktivity.
Podrobné pokyny pro odběr, zpracování a skladování půd pro biotransformační experimenty lze nalézt v literatuře (viz literatura 8, 10, 15, 26 a 27).
Před tím, než se zpracovaná půda použije ve zkoušce, provede se její předběžná inkubace, aby se umožnilo klíčení a odstranila se semena a aby se po změnách podmínek, ke kterým došlo od odběru nebo skladování po nastolení inkubačních podmínek, znovu ustavila rovnováha mikrobiálního metabolismu. Obecně postačuje předběžné inkubační období v délce od 2 do 28 dnů při podmínkách teploty a vlhkosti blížících se podmínkám zkoušky (viz literatura 15). Skladování a předběžná inkubace by dohromady neměly trvat déle než tři měsíce.

XXIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY

XXIII.1.9.1 Zkušební podmínky

XXIII.1.9.1.1 Zkušební teplota
V průběhu celé zkoušky by měly být půdy inkubovány v temnu při stálé teplotě, která je reprezentativní pro klimatické podmínky, ve kterých dojde k použití látky nebo k jejímu uvolnění. Pro zkoušky všech látek, které se dostávají do půdy v mírném klimatickém pásu, se doporučuje teplota (20 ± 2) °C. Teplota musí být monitorována.
V případě chemických látek aplikovaných nebo uvolňovaných v chladném klimatickém pásu (např. v severských zemích, během podzimu/zimy) se inkubují další vzorky půdy, avšak při nižší teplotě (např. při (10 ± 2) °C).

XXIII.1.9.1.2 Vlhkost
Pro účely dostatečného provzdušňování a výživy půdní mikroflóry by půda neměla být ani příliš vlhká, ani příliš suchá. Vlhkost půdy doporučená pro optimální růst mikroflóry se nachází v rozmezí od 40 % do 60 % retenční vodní kapacity a v rozmezí od 0,1 do 0,33 bar (viz literatura 6). Naposledy uvedený rozsah odpovídá rozsahu pF od 2,0 do 2,5. Typická vlhkost různých druhů půd je uvedena v dodatku 2. Pro transformační zkoušky při aerobních podmínkách se vlhkost nastaví a udržuje na hodnotě pF od 2,0 do 2,5 (viz literatura 3). Vlhkost půdy se vyjádří jako hmotnost vody na jednotku hmotnosti sušiny půdy, pravidelně se kontroluje (např. každé 2 týdny) vážením inkubačních baněk a ztráta vody se vyrovnává přidáním vody (nejlépe sterilně filtrované vody z vodovodu). Při upravování vlhkosti je třeba zabránit ztrátám zkoušené látky a/nebo transformačních produktů v důsledku těkání nebo případné fotodegradace, nebo je třeba tyto ztráty minimalizovat.
V případě transformačních zkoušek za anaerobních podmínek a za podmínek rýžového pole se půda nasytí vodou tak, že se zaplaví.

XXIII.1.9.1.3 Podmínky aerobní inkubace
V průtokových systémech se aerobní podmínky udržují občasným propláchnutím nebo nepřetržitým provětráváním zvlhčeným vzduchem. V biometrických baňkách se výměna vzduchu udržuje difuzí.

XXIII.1.9.1.4 Sterilní aerobní podmínky
Za účelem získání informací o možné abiotické transformaci zkoušené látky lze vzorky půdy sterilizovat (metody sterilizace jsou uvedeny v literatuře 16 a 29), exponovat je sterilní zkoušené látce (např. přidáváním roztoku přes sterilní filtr) a provzdušňovat je zvlhčeným sterilním vzduchem, jak je popsáno v oddíle 1.9.1.3. U půd z rýžových polí se půda a voda sterilizuje a inkubace se provede způsobem uvedeným v oddílu 1.9.1.6.

XXIII.1.9.1.5 Podmínky anaerobní inkubace
S cílem nastolit a udržovat anaerobní podmínky se půda, která byla exponována zkoušené látce a inkubována za aerobních podmínek 30 dnů nebo jeden poločas nebo po dobu odpovídající DT₅₀ (podle toho, co je kratší), zaplaví vodou (vrstva vody 1 – 3 cm) a inkubační systém se propláchne inertním plynem (např. dusíkem nebo argonem). Aerobní podmínky převažují v povrchových půdách a dokonce v podpovrchových půdách. Anaerobní podmínky se mohou vyskytovat jen příležitostně během zaplavení půdy po vydatných srážkách, nebo jsou-li takové podmínky ustaveny na rýžových polích. Zkušební systém musí umožňovat měření pH, koncentrace kyslíku a oxidačně-redukčního potenciálu a musí být vybaven zařízením pro zachycování těkavých produktů. Biometrický systém musí být uzavřený, aby bylo zabráněno přístupu vzduchu difuzí.

XXIII.1.9.1.6 Inkubace za podmínek rýžového pole
Pro účely studia transformace v půdách rýžových polí se půda zaplaví vrstvou vody o výšce asi 1 – 5 cm a zkoušená látka se aplikuje do vodné fáze (viz literatura 9). Doporučená tloušťka vrstvy půdy je alespoň 5 cm. Systém se provzdušňuje vzduchem jako za aerobních podmínek. Hodnota pH, koncentrace kyslíku a oxidačně-redukční potenciál vodné vrstvy se monitorují a zaznamenávají. Před zahájením transformačních studií je nezbytné alespoň dvoutýdenní předběžné inkubační období (viz oddíl 1.8.3.2).

XXIII.1.9.1.7 Délka zkoušky
Studie rychlosti a způsobu transformace by neměly za normálních podmínek trvat déle než 120 dnů (viz literatura 3, 6 a 8), neboť poté by podle očekávání mělo v umělém laboratorním systému izolovaném od přirozeného doplňování postupně docházet ke snižování mikrobiální aktivity půdy. Aerobní studie mohou být ukončeny daleko dříve než za 120 dnů, pokud je v dané době jasně dosaženo konečného transformačního schématu a konečné mineralizace. Zkoušku lze ukončit po 120 dnech, nebo pokud se transformovalo 90 % zkoušené látky, avšak pouze tehdy, vytvořilo-li se alespoň 5 % CO₂. Pokud je to nezbytné pro popis rozkladu zkoušené látky a tvorby a rozkladu hlavních transformačních produktů, lze studie prodloužit (např. na 6 nebo 12 měsíců) (viz literatura 8). Delší inkubační období by měla být zdůvodněna ve zprávě o zkoušce a doplněna měřením biomasy během těchto období a na jejich konci.

XXIII.1.9.2 Provedení zkoušky
Do každé z inkubačních baněk se vpraví asi 50 až 200 g půdy (hmotnost sušiny) (viz obrázky 1 a 2 v dodatku 3) a půda se jednou z metod uvedených v oddílu 1.8.2 exponuje zkoušené látce. Pokud se pro účely aplikace zkoušené látky použijí organická rozpouštědla, odstraní se z půdy odpařením. Půda se poté důkladně promíchá špachtlí nebo se baňka protřepe. Pokud se studie provádí za podmínek rýžového pole, půda a voda se po aplikaci zkoušené látky důkladně promísí. Malé podíly (např. 1 g) exponované půdy se analyzují na zkoušenou látku za účelem kontroly rovnoměrnosti distribuce. Alternativní metody jsou uvedeny níže.
Aplikované množství by mělo odpovídat nejvyššímu aplikovanému množství přípravku na ochranu rostlin doporučenému podle pokynů k použití a rovnoměrnému zapravení do vhodné hloubky na poli (např. do horní 10cm vrstvy půdy.
Výpočet výchozí koncentrace na základě plochy se provede takto:
$C_{\mathrm{puda}}=\frac{A\mathrm{kg}/\mathrm{ha}.{10}^6\mathrm{mg}/\mathrm{kg}}{lm.{10}^4{m}^2/\mathrm{ha}.d{\mathrm{kg}}_{\mathrm{puda}}/m^3}$
C_půda = výchozí koncentrace v půdě [mg∙kg^-1]; A = aplikační dávka [kg∙ha^-1]; l = tloušťka půdní vrstvy na poli [m], d = sypná hustota suché půdy [kg∙m^-3]. Zhruba platí, že aplikační dávka 1 kg∙ha^-1 vede ke koncentraci v půdě přibližně 1 mg∙kg^-1 v 10cm vrstvě (při předpokládané sypné hustotě 1 g∙cm^-3).Například u chemických látek aplikovaných na list nebo do půdy bez zapravení se pro výpočet množství chemické látky, které je třeba přidat do každé baňky, použije hloubka vrstvy půdy 2,5 cm. U chemických látek zapravovaných do půdy je příslušná hloubka specifikována v pokynech pro použití. U chemických látek obecně by mělo být aplikované množství odhadnuto na základě hlavní cesty vstupu do půdy; jsou-li například hlavní cestou vstupu do půdy kaly z čistíren odpadních vod, měla by být chemická látka přidána do kalu v koncentraci, která odráží očekávanou koncentraci v kalu, a množství kalu zapravené do půdy by mělo odpovídat normálnímu množství kalu zapravovanému do zemědělských půd. Pokud tato koncentrace není dostatečná pro identifikaci hlavních transformačních produktů, může napomoci inkubace samostatných půdních vzorků obsahujících vyšší koncentrace, avšak neměly by být používány nadměrné koncentrace, které mají vliv na mikrobiální funkce (viz oddíly 1.5 a 1.8.2).
Jinou možností je expozice velké dávky půdy (tj. 1 až 2 kg), její důkladné promísení vhodným míchacím zařízením a přenesení malých podílů o hmotnosti 50 až 200 g do inkubačních baněk (např. pomocí děliče vzorku). Malé podíly (např. 1 g) exponované půdy se analyzují na zkoušenou látku za účelem kontroly rovnoměrné distribuce. Takový postup se upřednostňuje, neboť umožňuje stejnoměrnější rozptýlení zkoušené látky v půdě.
Neexponované vzorky se inkubují za stejných podmínek (aerobních) jako vzorky exponované zkoušené látce. Tyto vzorky se použijí pro stanovení biomasy během studií a na jejich konci.
Pokud se látka aplikuje do půdy rozpuštěná v organickém rozpouštědle (organických rozpouštědlech), inkubují se vzorky půdy vystavené témuž množství rozpouštědla (rozpouštědel) za týchž (aerobních) podmínek jako vzorky exponované zkoušené látce. Tyto vzorky se použijí pro stanovení biomasy na začátku studií, v jejich průběhu a na jejich konci za účelem kontroly účinků rozpouštědla (rozpouštědel) na mikrobiální biomasu.
Baňky obsahující exponovanou půdu se buď zapojí do průtokového systému popsaného na obrázku 1, nebo se uzavřou absorbční kolonou, jak je uvedeno na obrázku 2 (viz dodatek 3).

XXIII.1.9.3 Odběr vzorků a měření
V příslušných časových intervalech se vyberou duplikátní inkubační baňky, vzorky půd se extrahují vhodnými rozpouštědly různé polarity a analyzují na zkoušenou látku a/nebo na transformační produkty. V dobře založených studiích je k dispozici dostatečný počet baněk, aby bylo možné ke každému odběru vybrat dvě baňky. V různých časových intervalech (v 7denních intervalech během prvního měsíce a po prvním měsíci v 17denních intervalech) během inkubace každého vzorku půdy a dále na konci inkubace se také odeberou absorpční roztoky nebo tuhé absorpční materiály a analyzují se na těkavé produkty. Kromě vzorku půdy odebraného ihned po aplikaci (vzorek ze dne 0) se provede alespoň dalších 5 odběrů. Časové intervaly se zvolí tak, aby bylo možné stanovit schéma rozkladu zkoušené látky a způsob tvorby a rozkladu transformačních produktů (např. po 0, 1, 3, 7 dnech; po 2, 3 týdnech; po 1, 2, 3 měsících atd.).
V případě zkoušené látky značené isotopem ¹⁴C se spálením kvantitativně stanoví neextrahovatelná radioaktivita a pro každý vzorkovací interval se vypočte látková bilance.
V případě anaerobní inkubace nebo inkubace za podmínek rýžového pole se půda a vodná fáze analyzují na zkoušenou látku a transformační produkty buď společně, nebo se před extrakcí a analýzou oddělí filtrací nebo centrifugací.

XXIII.1.9.4 Nepovinné zkoušky
Pro odhad vlivu teploty a vlhkosti půdy na rychlosti transformace zkoušené látky a/nebo jejích transformačních produktů v půdě mohou být užitečné aerobní nesterilní studie při další teplotě nebo vlhkosti půdy.
O další charakterizaci neextrahovatelné radioaktivity se lze pokusit například použitím metody extrakce tekutinou v nadkritickém stavu.

XXIII.2. DATA

XXIII.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Pro každý vzorkovací interval se uvede množství zkoušené látky, transformačních produktů, těkavých látek (pouze v %) a neextrahovatelných látek v procentech výchozí koncentrace, popřípadě v mg na kg půdy (na hmotnost sušiny). Pro každý vzorkovací interval se uvede látková bilance v procentech výchozí koncentrace. Grafické znázornění závislosti koncentrace zkoušené látky na čase umožní provést odhad jejího poločasu transformace nebo hodnoty DT₅₀. Měly by být identifikovány hlavní transformační produkty a měly by být také sestrojeny křivky jejich závislosti na čase, aby se ukázala rychlost jejich tvorby a rozkladu. Hlavním transformačním produktem je jakýkoli produkt, který kdykoli během studie představuje ≥ 10 % aplikované dávky.
Zachycené těkavé produkty jsou určitým ukazatelem těkavosti zkoušené látky a jejích transformačních produktů z půdy.
Přesnější stanovení poločasů nebo hodnot DT₅₀ a popřípadě hodnot DT₇₅ a DT₉₀ se provede výpočtem za použití vhodného modelu kinetiky. Společně s hodnotami poločasu a DT₅₀ se uvede popis použitého modelu kinetiky, řád kinetiky a koeficient determinace (r²). Pokud není r² < 0,7, upřednostňuje se kinetika prvního řádu. Podle možnosti se výpočty použijí také na hlavní transformační produkty. Příklady vhodných modelů jsou popsány v literatuře 31 až 35.
V případě studií rychlosti prováděných při různých teplotách se závislost rychlosti transformace na teplotě popíše v rozsahu experimentálních teplot pomocí Arrheniovy rovnice:
$k=A·e^{-\mathrm{BIT}}\mathrm{nebo}\ln k=\mathrm{lnA}-\frac{B}{T},$
kde ln A a B jsou regresní konstanty získané z úseku na ose y a ze směrnice regresní přímky závislosti ln k na 1/T, kde k je rychlostní konstanta při teplotě T a T je teplota v Kelvinech. Je třeba věnovat pozornost omezení rozsahu teplot, v němž platí Arrheniova rovnice, jestliže transformaci určuje mikrobiální činnost.

XXIII.2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Přestože se studie provádějí v umělém laboratorním systému, umožňují výsledky odhadnout rychlost transformace zkoušené látky a rovněž rychlost tvorby a rozkladu transformačních produktů za polních podmínek (viz literatura 36 a 37).
Studie transformačního způsobu zkoušené látky poskytuje informaci o způsobu, jakým se mění struktura aplikované látky v půdě působením chemických a mikrobiálních reakcí.

XXIII.3. ZPRÁVY

XXIII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:
Zkoušená látka:
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (s uvedení polohy značícího atomu (značících atomů) při použití radionuklidů) a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti (viz oddíl 1.5);
— čistota zkoušené látky (obsah nečistot);
— popřípadě radiochemická čistota značené chemické látky a specifická aktivita;
Referenční látky:
— chemický název a struktura referenčních látek použitých k charakterizaci a/nebo identifikaci transformačního produktu;
Zkušební půdy:
— podrobné údaje o místě odběru;
— datum a postup odběru vzorků půdy;
— vlastnosti půdy, např. pH, obsah organického uhlíku, struktura (% písku, % prachu, % jílu), kationtová výměnná kapacita, sypná hustota, schopnost zadržet vodu a mikrobiální biomasa;
— doba skladování půdy a podmínky skladování (pokud byla skladována);
Zkušební podmínky:
— datum provedení studií;
— množství aplikované zkoušené látky;
— použitá rozpouštědla a metoda aplikace zkoušené látky;
— hmotnost exponované půdy na začátku zkoušky a hmotnost půdy odebírané pro analýzu v každém intervalu;
— popis použitého inkubačního systému;
— rychlosti průtoku vzduchu (pouze u průtokových systémů);
— zkušební teplota;
— vlhkost půdy během inkubace;
— mikrobiální biomasa na začátku aerobních studií, během nich a na jejich konci;
— pH, koncentrace kyslíku a oxidačně-redukční potenciál na začátku anaerobních studií a studií za podmínek rýžového pole, během nich a na jejich konci;
— metoda (metody) extrakce;
— metody kvantitativního stanovení a identifikace zkoušené látky a hlavních transformačních produktů v půdě a v absorpčních materiálech;
— počet duplikátních vzorků a počet kontrol.
Výsledky:
— výsledky stanovení mikrobiální aktivity;
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod;
— hodnoty výtěžnosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny v oddíle 1.7.1);
— tabulky s výsledky vyjádřenými v % výchozí aplikované dávky, popřípadě v mg na kg půdy (vztaženo na hmotnost sušiny půdy);
— látková bilance během studií a na jejich konci;
— charakterizace neextrahovatelné (vázané) radioaktivity nebo reziduí v půdě;
— kvantifikace uvolněného CO₂ a dalších těkavých sloučenin;
— křivky závislostí koncentrací zkoušené látky, popřípadě hlavních transformačních produktů v půdě na čase;
— poločas nebo hodnoty DT₅₀, DT₇₅ a DT₉₀ pro zkoušenou látku, popřípadě i pro hlavní transformační produkty včetně příslušných intervalů spolehlivosti;
— odhad rychlosti abiotického rozkladu za sterilních podmínek;
— posouzení kinetiky transformace pro zkoušenou látku, popřípadě i pro hlavní transformační produkty;
— případný návrh způsobu transformace;
— diskuse a interpretace výsledků;
— nezpracovaná data (tj. chromatogramy jednotlivých vzorků, příklady výpočtu rychlostí transformace a metody použité pro identifikaci transformačních produktů).

XXIII.4. LITERATURA

(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.

(3) Evropská unie (EU) (1995). Směrnice Komise 95/36/ES ze dne 14. července 1995, kterou se mění směrnice Rady 91/414/EHS o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh. Příloha II část A a příloha III část A: Rozpad a chování v životním prostředí.

(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.

(6) ISO/DIS 11266 (1994). Soil Quality – Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil, Technical Committee ISO/TC 190/SC 4.

(7) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Vyd. Mark R. Lynch.

(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).

(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Itálie, 18. – 20. ledna 1995.

(11) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In: Interactions between Herbicides and the Soil (Vyd. R. J. Hance), Academic Press, 123 – 157.

(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).

(13) T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)

(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (přijato 12. května 1981)

(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(16) Příloha V směrnice 67/548/EHS

(17) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D. H. Hutson, T. R. Roberts, J. Wiley &amp; Sons. Vol 1, 85 – 114.

(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) a Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. Vyd. A. Klute, Agronomy Series No 9, 2. vydání.

(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. Vyd. A. L. Page, R. H. Miller, D. R. Kelney, Agronomy Series No 9, 2. vydání.

(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis, 1. vydání.

(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.

(24) Anderson, J. P. E., Domsch, K. H. (1978). A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215 – 221.

(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: Fumigation-extraction method.

(26) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In: Pesticide Effects on Soil Microflora. Vyd. L. Somerville, M. P. Greaves, Taylor &amp; Francis, 45 – 60.

(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16^th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105 – 120.

(28) Keuken O., Anderson J. P. E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In: Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59 – 63 (SETAC-Europe).

(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In: Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).

(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.

(31) Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.

(32) Hamaker, J. W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.

(33) Goring, C. A. I., Laskowski, D. A., Hamaker, J. W., Meikle, R. W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In: Environmental Dynamics of Pesticides. Vyd. R. Haque, V. H. Freed, 135 – 172.

(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 39, 188 – 204.

(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47 – 60.

(36) Gustafson D. I., Holden L. R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032 – 1041.

(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In: Interactions between Herbicides and the Soil. Vyd. R. J. Hance, Academic Press, 83 – 122.