A. Ukazatele, pro které jsou stanoveny metody rozboru
| D-cycloserin | 400 mg |
| polymyxin B ve formě síranu | 25 mg |
| indoxyl-β-D-glukosid (předem rozpuštěný v 8 ml sterilní vody) | 60 mg |
| sterilně zfiltrovaný 0,5 % fenolftalein difosforečnanový roztok | 20 ml |
| sterilně zfiltrovaný 4,5 % FeCl3 . 6 H2O | 2 ml |
Tyto součásti bazálního média se rozpustí, pH se upraví na 7,6 a médium se na dobu 15 minut umístí v autoklávu při 121 °C. Poté se médium nechá zchladnout a přidají se následující přísady:
***) v bodě 4.1 uvedené normy se místo očkování použije technika membránové filtrace 100 ml vzorku vody.
**) jedná se o doporučené metody; pro stanovení tohoto ukazatele může laboratoř použít i jinou metodu, pokud prokáže její vhodnost pro daný účel
*) pro účely ověřovacího monitorování založeného na posouzení a řízení rizik v systému zásobování pitnou vodou a na doplnění kultivačních metod lze použít i jiné metody, jako je norma ISO/TS 12869, rychlé kultivační metody, nekultivační metody a molekulární metody, zejména kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR)
| Ukazatel | Metoda | Alternativní metoda |
|---|---|---|
| Escherichia coli | ČSN EN ISO 9308-1 | ČSN EN ISO 9308-2 |
| koliformní bakterie | ČSN EN ISO 9308-1 | ČSN EN ISO 9308-2 |
| intestinální enterokoky | ČSN EN ISO 7899-2 | |
| Pseudomonas aeruginosa | ČSN EN ISO 16266 | ČSN EN ISO 16266-2 |
| počty kolonií při 22 °C a 36 °C | ČSN EN ISO 6222 | |
| mikroskopický obraz | ČSN 757712 a ČSN 75 7713 | |
| Clostridium perfringens (včetně spor) | ČSN EN ISO 14189 | |
| atypická mykobakteria | ČSN 75 7840 | |
| Legionella spp. | ČSN EN ISO 11731 *) | |
| Somatické kolifágy | ČSN EN ISO 10705-2 a ČSN ISO 10705-3 **) | |
| Staphylococcus aureus | ČSN EN ISO 6888-1 (beze změny A1) ***) |
1. Clostridium perfringens (včetně spor):
| Bazální médium: | |
|---|---|
| tryptóza | 30 g |
| kvasnicový extrakt | 20 g |
| Sacharoza | 5 g |
| hydrochlorid L-cysteinu | 1 g |
| MgSO4 . 7 H2O | 0,1 g |
| bromkrezolová purpurová červeň | 40 mg |
| agar | 15 g |
| voda | 1000 ml |
Membránová filtrace, po které následuje anaerobní kultivace membrány na m-CP agaru při 44 ± 1 °C po dobu 21 ± 3 hod. Počítá se četnost neprůsvitných žlutých kolonií, jejichž zbarvení přejde do růžova nebo červena po vystavení parám amoniaku po dobu 20 až 30 sekund.
Postup stanovení:
Agar m-CP má toto složení:
Pro stanovení atypických mykobakterií lze použít jednu z následujících metod:
2. Atypická mykobakteria:
Počty mykobakterií na 1 l vody se vypočtou ve vztahu k objemu přefiltrované vody, objemu vzorku po centrifugaci, počtu očkovaných ploten a velikosti očkovaného inokula.
a) Metoda s laurylsulfátem sodným:
Membránovou filtrací (filtr o porozitě 0,45 mikrometrů) se zpracuje s pomocí vodní vývěvy 0,5 l vody. Za sterilních podmínek se filtr vyjme pinzetou a nůžkami rozstříhá na 6 - 8 proužků, které se přemístí do centrifugační nádobky s 20 ml sterilní destilované vody a vytřepou 10 minut na třepačce. Roztok se pak přelije do další nádobky a centrifuguje 20 minut při 2 000 g až 3 000 g. Supernatant se odlije a sediment se dekontaminuje 3 ml roztoku 3% laurylsulfátu sodného s 1 % NaOH. Po 20 minutách třepání na třepačce se přidá 25 ml sterilní destilované vody a centrifuguje se opět při 2000 g až 3000 g po dobu 20 minut. Po odlití supernatantu se k sedimentu přidají cca 2 ml fyziologického roztoku tak, aby se výsledný objem vzorku ve zkumavce zarovnal na určitou jeho hodnotu, která poslouží pro výpočet kvantity. Po homogenizaci pipetou se vzorek očkuje v množství po 0,25 ml na šest vaječných půd (3 Löwensteinovy-Jensenovy a 3 Ogawovy půdy). Vždy dvě z naočkovaných půd se (1 L.-J. a 1 Ogawova) se inkubují při 30 °C, 37 °C a 42 °C. Výsledek se odečítá za 1, 3, 6 a 9 týdnů, pro stanovení počtů se použijí výsledky po 9 týdnech inkubace. V případě, že kmen neroste při určité teplotě, se výsledky počítají jen z těch teplot inkubace, při nichž je kmen schopen růst (některé mykobakterie nerostou při teplotě nižší než 37 °C). U vyrostlých kolonií se zaznamenává jejich morfologie a pigmentace a mikroskopicky se Ziehl-Neelsenovým barvením ověří jejich acidorezistence. V případě pozitivity se provádí ve specializovaných mykobakteriologických laboratořích druhová identifikace izolovaného kmene.
K dekontaminaci vody je možné použít také chlorhexidin. K sedimentu se přidá 10 ml 0,2% vodného roztoku chlorhexidinu, ručně protřepe a ponechá 24 hodin při pokojové teplotě. Druhý den po centrifugaci a po promytí sedimentu 10 ml sterilní destilované vody se sediment po další centrifugaci při 2 000 g až 3000 g zpracuje stejně jako při metodě s laurylsulfátem sodným.
Postup stanovení:
Filtr se vyjme sterilní pinzetou a vloží do sterilní 30 ml plastikové nádobky, do níž jsou přidány 2 ml sterilní destilované vody. Na vortexu je plastiková nádobka protřepána po dobu 10 vteřin. Na povrch půd v Petriho miskách je suspenze inokulována po 0,2 ml a 0,1 ml je použita k nátěru na podložní sklíčko pro barvení metodou podle Ziehl-Neelsena. Kultivace na jedné Petriho misce s Löwenstein-Jensenovou půdou a jedné Petriho misce s Ogawovou půdou při 30 °C, 37 °C a 42 °C. Hodnocení se provádí 1x týdně do 9 týdnů inkubace.
b) Metoda s cetylpyridinium chloridem (CPC):
Postup stanovení:
Membránovou filtrací (filtr o porozitě 0,45 mikrometrů) se zpracuje s pomocí vodní vývěvy 1 litr vody. Pro dekontaminaci vzorku vody se použije roztok CPC ve výsledné koncentraci 0,005 %, který se připraví do sterilní destilované vody.
Dekontaminace vzorku vody je provedena následujícím způsobem: 1 díl 0,05 % roztoku CPC je přidán k 9 dílům vzorku vody. Po uzavření láhve se její obsah po dobu 30 sekund protřepává, pak se nechá 30 minut stát. Poté se ihned provede filtrace přes celulózový membránový filtr o průměru 50 mm a velikosti pórů 0,45 μm.
Filtr je propláchnut po ukončení filtrace 500 ml sterilní destilované vody, aby se odstranila residua CPC.
Do protokolu se zaznamenávají zjištěné výsledky na jednotlivých půdách: počet kolonií na půdě, při masivním růstu na výseči s reprezentativním nárůstem, morfologie kolonií, mikroskopické ověření vyrostlých kolonií. Pokud je zjištěn růst více mykobakteriálních druhů, uvádí se počet každého druhu zvlášť. Pro identifikaci je odebráno 10 kolonií, z nichž je připravena subkultura na pevné půdě (Löwenstein-Jensenově nebo Ogawově) pro provedení identifikačních testů. U některých suspektních kolonií mykobakterií je možno provést vyšetření GEN Probe přímo z primokultury z dostatečného inokula. Konečné hodnocení růstu je provedeno po 9 týdnech inkubace, stejně tak uzavření negativních vyšetření; u negativních se inkubace prodlouží do 12 týdnů. Pokud v průběhu šestitýdenní inkubace přerostou všechny naočkované půdy nespecifickou bakteriální flórou, uzavře se výsledek dříve.
Pro stanovení počtů se použijí výsledky po 9 týdnech inkubace, popřípadě po 12 týdnech inkubace, pokud po 9 týdnech bylo vyšetření negativní. V případě, že kmen neroste při určité teplotě, se výsledky počítají jen z údajů těch teplot inkubace, při nichž je kmen schopen růst. Počty kolonií mykobakterií na 1 litr vody se vypočítají ve vztahu k objemu přefiltrované vody, objemu vzorku při vytřepávání filtru, velikosti očkovaného inokula a počtu inokulovaných ploten.