9. Identifikace
Čisté kultury pravděpodobné izolované kultury Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují za použití nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.
V případě potřeby se zahrne pro každý provedený test známý referenční kmen.
9.1. Nutriční a enzymatické identifikační testy
Zjišťují se následující fenotypické vlastnosti. Veškerá média by se měla inkubovat při 21 °C a po šesti dnech by měla být vyhodnocena. Pokud nedošlo k žádnému růstu, inkubuje se po dobu nejvýše 20 dní.
Všechny testy musí zahrnovat kontrolu se známým kmenem Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Nutriční a fyziologické testy se musí provádět za použití inokula ze subkultur živného agaru. Morfologická srovnání se musí provádět z kultur z živného dextrózového agaru.
| Test | Očekávaný výsledek |
|---|---|
| Oxidačně-fermentační (O/F) | inertní nebo slabě oxidační |
| Aktivita oxidázy | - |
| Aktivita katalázy | + |
| Redukce nitrátů | - |
| Aktivita ureázy | - |
| Tvorba H2S | - |
| Tvorba indolu | - |
| Využívání citrátu | - |
| Hydrolýza škrobu | - nebo slabá |
| Růst při 37 °C | - |
| Růst v 7% NaCl | - |
| Hydrolýza želatiny | - |
| Hydrolýza eskulinu | + |
| Tvorba kyseliny z: | |
| - glycerolu | - |
| - laktózy | - nebo slabá |
| - rhamnózy | - |
| - salicinu | - |
| Gramovo barvení (dodatek 9) |
9.2. IF test
a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk/ml v pufru na IF (dodatek 3).
b) Připraví se série dvojnásobného ředění vhodného antiséra.
c) Provede se IF postup (oddíl 4).
d) Pozitivního výsledku IF testu je dosaženo, jestliže IF titr kultury odpovídá titru pozitivní kontroly.
9.3. PCR test
a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na ml ve sterilní vodě (UPW)
b) Zahřívá se 100 µl suspenze buněk v uzavřených mikrozkumavkách v ohřívacím bloku nebo vřící vodní lázni při teplotě 100 °C po dobu 4 minut. V případě potřeby se může lýza buněk podpořit přidáním čerstvě připraveného NaOH do konečné koncentrace 0,05 M. Vzorky lze potom uložit při teplotě -16 až -24 °C až do použití.
c) Pro amplifikaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus specifických amplikonů se použijí vhodné postupy PCR (např. Pastrik, 2000; viz dodatek 4; Li a de Boer, 1995; Mills a kol., 1997; Pastrik a Rainey, 1999; Schaad a kol., 1999).
d) Identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je pozitivní, pokud jsou amplikony PCR stejné velikosti a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentu jako pozitivní kontrolní kmen.
9.4. FISH test
a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na ml v UPW.
b) Provede se postup FISH (oddíl 5)
c) Test FISH je pozitivní, jsou-li dosaženy stejné reakce kultury a pozitivní kontroly.
9.5. Analýza mastných kyselin (FAP)
a) Kultura se pěstuje na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) po dobu 72 hodin při teplotě 21 °C (+/- 1°C).
b) Použije se vhodný postup FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).
c) Test FAP je pozitivní, pokud je profil podezřelé kultury identický s profilem pozitivní kontroly. Přítomnost charakteristických mastných kyselin 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 a 17:0 Anteiso jasně svědčí o přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Jiné rody jako Curtobacterium, Arthrobacter a Micrococcus také obsahují některé z těchto kyselin, ale 15:1 Anteiso A je pro tyto bakterie neobvyklá kyselina, která se však vyskytuje ve všech Clavibacter spp. v rozmezí 1-5 %. U Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se hodnota obvykle pohybuje kolem 5 %.
9.6. BOX-PCR
a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na ml v UPW.
b) Provede se test postupem podle Smith a kol., 2001.