9.3. PCR test

a) Připraví se suspenze přibližně 10⁶ buněk na ml ve sterilní vodě (UPW)

b) Zahřívá se 100 µl suspenze buněk v uzavřených mikrozkumavkách v ohřívacím bloku nebo vřící vodní lázni při teplotě 100 °C po dobu 4 minut. V případě potřeby se může lýza buněk podpořit přidáním čerstvě připraveného NaOH do konečné koncentrace 0,05 M. Vzorky lze potom uložit při teplotě -16 až -24 °C až do použití.

c) Pro amplifikaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus specifických amplikonů se použijí vhodné postupy PCR (např. Pastrik, 2000; viz dodatek 4; Li a de Boer, 1995; Mills a kol., 1997; Pastrik a Rainey, 1999; Schaad a kol., 1999).

d) Identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je pozitivní, pokud jsou amplikony PCR stejné velikosti a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentu jako pozitivní kontrolní kmen.