2. Diagnóza původce hnědé hniloby

2.1. Příznaky

Rychlé screeningové testy mohou napomoci předběžné diagnóze, ale nejsou dostačující. Použije se jeden nebo více následujících testů:
2.2. Rychlé screeningové testy

2.3. Postup při izolaci

2.4 Identifikační testy Ralstonia solanacearum
Testy potvrzující výskyt R. solanacearum v podezřelých izolátech jsou popsány v bodu 6.2.

2.1.1. Příznaky u bramboru
Rostlina bramboru. Raná fáze infekce v polních podmínkách se rozpozná vadnutím listů směrem k vrcholu rostliny při vysokých teplotách během dne, přičemž v noci dochází k zotavení. V raných fázích vadnutí zůstávají listy zelené, ale později žloutnou a objevují se hnědé nekrózy. Dochází také k ohýbání listů dolů. Vadnutí jednoho výhonku nebo celé rostliny se rychle stává nevratným a končí kolapsem a uhynutím rostliny. Z cévních svazků napříč uříznutých stonků zvadlých rostlin obvykle vytéká hnědý a mléčný bakteriální sliz nebo je možné sliz vymáčknout. Při ponoření uříznutého stonku svisle do vody se z cévních svazků táhnou vlákna slizu.
Hlíza bramboru. Hlízy bramboru je třeba překrojit napříč u pupkového konce a podélně přes pupkový konec. V rané fázi se infekce pozná podle láhvově žlutého až světle hnědého zabarvení cévního prstence, ze kterého po několika minutách začne prýštit bledý krémový bakteriální sliz. Později se cévní zbarvení stává výrazněji hnědým a odumření se může rozšířit do parenchymatického pletiva. V pokročilejších fázích se infekce rozšíří vně od pupkového konce hlízy a z oček může vytékat bakteriální sliz, na který se přilepují částice půdy. Na slupce se mohou objevit červenohnědá, lehce propadlá místa jako důsledek vnitřního kolapsu cévního pletiva. V pokročilejších fázích infekce je obvyklý sekundární rozvoj měkkých hnilob bakteriálního a houbového původu.

Rostlina rajčete. Prvním viditelným příznakem je povadlý vzhled nejmladších listů. Za příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy kolem 25°C, při nasycené vzdušné vlhkosti) se během několika málo dní rozvine kroucení listů směrem dolů a vadnutí na jedné straně rostliny nebo celé rostliny, které končí jejím úplným odumřením. Za méně příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy méně než 21°C) rostlina tolik nevadne, ale na stonku se může tvořit větší počet postranních výhonů. Je možné pozorovat vodou nasáklé pruhy od spodu stonku, které jsou dokladem odumírání cévního systému. Při příčném řezu stonkem vylučují hnědě zbarvená vodivá pletiva bílý nebo nažloutlý bakteriální sliz.
2.1.2. Příznaky u rajčete

2.1.3. Příznaky u jiných hostitelů
Rostliny Solanum dulcamara a S. nigrum. Za normálních podmínek jsou u těchto plevelných hostitelských rostlin zřídkakdy pozorovány příznaky vadnutí, pokud teploty půdy nepřevyšují 25°C nebo není extrémně vysoká koncentrace inokula (např. u rostliny S. nigrum rostoucí u nemocné rostliny bramboru nebo rajčete). Při vadnutí jsou příznaky stejné jako u rostliny rajčete. Nevadnoucí rostliny S. dulcamara, která má stonky a kořeny ve vodě, mohou vykazovat vnitřní světle hnědé zbarvení vodivých pletiv na příčném řezu spodní části stonku nebo částí stonku pod vodou. Z řezu cévních svazků mohou vytékat bakterie nebo mohou tvořit vlákna slizu, jestliže je řez stonku ponořen svisle do vody, a to i při absenci příznaků vadnutí.

2.2.1. Test na výtok slizu ze stonku
(Viz. 6.1.1.)

2.2.2. Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu (PHB)
Charakteristické granule PHB v buňkách R. solanacearum jsou zviditelněny obarvením tepelně fixovaných skvrn bakteriálního slizu z infikovaného pletiva na mikroskopickém sklíčku nilskou modří A nebo súdánskou černí (viz. oddíl 6.1.2.).

(Viz. oddíl 6.1.3.)
2.2.3. Sérologické aglutinační testy

Dalšími vhodnými rychlými screeningovými testy jsou test IF (viz.oddíl 6.1.5.), test FISH (viz.oddíl 6.1.7.), testy ELISA (viz.oddíl 6.1.8.) a testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.).
2.2.4. Jiné testy

a) Odebere se sliz nebo vrstva zbarveného pletiva z cévního prstence hlízy bramboru nebo z cévních vláken stonku rostliny bramboru, rajčete nebo jiné vadnoucí hostitelské rostliny. Suspenduje se v malém množství sterilní destilované vody nebo 50mM fosfátového pufru (dodatek 4) a nechá se 5-10 minut stát.

b) Připraví se řada desetinásobných ředění suspenze.

c) Přenese se 50-100 μl suspenze a roztoku na universální živnou půdu (NA, YPGA neboSPA; viz. dodatek 2) a/nebo Kelmanovo tetrazolové médium (dodatek 2) a/nebo validované selektivní médium (např. SMSA, viz. dodatek 2). Rozetře se metodou zřeďovacích roztěrů. Připraví se případně samostatné misky s rozředěnou buněčnou suspenzí R. solanacearum biovar 2 k pozitivní kontrole.

- U Kelmanova tetrazolového média a média SMSA jsou spirálky krvavě červeně zbarvené. Aviruletní formy R. solanacearum tvoří malé kruhové nefluidní máslovité kolonie, které jsou zcela temně červené.
- Na universální živné půdě vytvářejí virulentní izoláty R. solanacearum perlově krémově bílé, ploché, nepravidelné a fluidní kolonie, často s charakteristickými spirálkami ve středu. Aviruletní formy R. solanacearum tvoří malé kruhové nefluidní máslovité kolonie, které jsou zcela krémově bílé.
d) Inkubuje se 2-6 dní při teplotě 28°C.