B. METODY DIAGNÓZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PŮVODCE HNĚDÉ HNILOBY
Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou součástí:
iii) identifikace Ralstonia solanacearum (R. solanacearum)
ii) detekce Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru, rostlin bramboru, rostlin rajčete a jiných hostitelských rostlin, a ve vzorcích vody a půdy,
i) diagnózy hnědé hniloby v hlízách bramboru a bakteriálního vadnutí bramboru, rajčete a některých dalších hostitelských rostlin,
Testovací parametry musí zajišťovat stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní R. solanacearum jako stanovené prahy vybraných metod.
Optimalizované protokoly pro různé metody, schválená činidla a podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku 1.
Pokud je první screeningový test pozitivní, existuje podezření na infekci R. solanacearum a musí být proveden druhý screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle daného schématu. Jestliže je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není považován za infikovaný R. solanacearum.
Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
Potvrzená přítomnost podle § 5 odst. 1 vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury R. solanacearum s potvrzením patogenity.
Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují použití životaschopných kultur R. solanacearum jako kontrolních materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek stanovených příslušným povolením Ústavu.
OBECNÉ ZÁSADY
Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.
Zcela nezbytná je přesná příprava pozitivních kontrol.
Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech. První pozitivní screeningový test ( test IF, PCR/FISH, selektivní izolace) musí být potvrzen druhým screeningovým testem založeném na jiném biologickém principu.
LITERATURA
Dodavatelé: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
Pěstování lilku a rajčete
Rostliny lilku a rajčete by se měly pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:
Dodatek 5

Vhodná odrůda lilku vejcoplodého:	„Black Beauty“
Vhodná odrůda rajčete:	„Moneymaker“

Vysejí se semena rajčete (Lycopersicon esculentum) nebo lilku (Solanum melongena) do pasterizovaného výsevního substrátu. Sazeničky s plně rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přesadí do pasterizovaného pěstebního substrátu.

Délka dne:		14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;
Teplota:	den:	21 až 24 °C,
	noc:	14 až 18 °C.

Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk

1. Použití postupových diagramů

- Extrakt bramboru popsaný níže může být rovněž použit pro zjištění původce bakteriální kroužkovitosti bramboru. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Poznámka:
3.1.1. Příprava vzorků
- Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.
- Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na jeden test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dipozici menší množství hlíz.
Nepovinné ošetření před přípravou vzorku

Roztoky antibiotik se uchovávají a skladují při teplotě 4 °C v temnu a musí se spotřebovat do 1 měsíce.
b) Validované selektivní živné půdy
Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Základní živná půda
Casamino kyseliny (Difco)	1,0 g
Bacto-Pepton (Difco)	10,0 g
Glycerol	5,0 ml
Bacto-Agar (Difco) (viz pozn. 2)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Krystalová violeť (Sigma)	5 mg/l
Polymixin-B-sulfát (Sigma P1004)	600 000 U (přibližně 100 mg)/l
Bacitracin (Sigma B-0125)	1 250 U (přibližně 25 mg)/l
Chloramfenikol (Sigma C-3175)	5 mg/l
Penicilín-G (Sigma P-3032)	825 U (přibližně 0,5 mg)/l
2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid (Sigma)	50 mg/l

Ochladí se na 50 °C a přidá filtrem sterilizovaný vodný roztok následujících složek, aby se získala stanovená konečná koncentrace:
Poznámky:
Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.
Nutno zabránit přílišnému vysušení média.
Každá nově připravená šarže živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické kolonie.
Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)

Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996)
Provede se příprava jako pro selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechá se Bacto-Agar a 2,3,5- trifenyltetrazolium chlorid.
Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)

Sacharóza	10 g
Proteázový pepton	5g
K2 HPO4	0,5 g
MgSO4	0,25 g
NaNO3	0,25 g
Destilovaná voda	1,00 l

c) Validované obohacené živné půdy
Steriluje se tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochladí se na 50 °C.
Přidá se antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.

Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů

Laboratoř (1)	Místo	Země
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit	Vídeň a Linec	Rakousko
Departement Gewasbescherming	Merelbeke	Belgie
Plantedirektoratet	Lyngby	Dánsko
Central Science Laboratory	York	Anglie
Scottish Agricultural Science Agency	Edinburgh	Skotsko
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Unité de Bactériologie	Angers	Francie
Laboratoire National de la Protection Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre	Le Rheu	Francie
Biologische Bundesanstalt	Kleinmachnow	Německo
Pflanzenschutzamt Hannover	Hannover	Německo
State Laboratory	Dublin	Irsko
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali	Boloň	Itálie
Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi Fitosanitari	Verona	Itálie
Nederlandse Algemene Keuringsdienst	Emmeloord	Nizozemsko
Plantenziektenkundige Dienst	Wageningen	Nizozemsko
Direcção-General de Protecção das Culturas	Lisabon	Portugalsko
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia	Salamanca	Španělsko
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias	Valencie	Španělsko
Swedish University of Agricultural Sciences	Uppsala	Švédsko
(1) Kontakty: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 1

Dodatek 2

11) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.
10) Patogen je obvykle snadno izolovatelný z rostlinného materiálu vykazujícího příznaky metodou zřeďovacích roztěrů (postupným ředěním) (viz. v oddíle 2.3.).
9) Test PCR bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.6.
8) Test ELISA bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.8.
7) Test FISH bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.7.
6) Test IF bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.5.
5) Sérologické aglutinační testy bakteriálního slizu nebo extraktů z pletiva vykazujícího příznaky jsou popsány v oddíle 6.1.3.
4) Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu je popsán v oddíle 6.1.2.
3) Test na výtok slizu ze svazků cévních stonku je popsán v oddíle 6.1.1.
2) Rychlé diagnostické testy usnadňují předběžnou diagnózu, ale nejsou dokonalé. Negativní výsledek naznačuje vždy nepřítomnost patogenu.
1.1. Postupový diagram pro diagnózu hnědé hniloby a bakteriálního vadnutí (Ralstonia solanacearum) hlíz bramboru a rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin vykazujících příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí

Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogena z infikovaného vodivého pletiva na selektivní živné půdě a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury Ralstonia solanacearum.
1) Popis příznaků se nachází v oddíle 2.1.
14) Test patogenity je popsán v bodu 6.3.
13) Spolehlivá identifikace čistých kultur R. solanacearum se provede pomocí testů popsaných v bodu 6.2. Dílčí specifická charakteristika je nepovinná, ale doporučuje se pro každý nový případ.
12) Kultivace může selhat při pokročilých fázích infekce z důvodů konkurence nebo bujného růstu saprofytických bakterií. Jestliže jsou příznaky infekce typické, ale izolační test je negativní, musí se izolace opakovat, nejlépe kultivací na selektivních živných půdách.

13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.
12) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že se jedná o R. solanacearum, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.
11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační testy.
10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.
9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.
8) Testy ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.8.
7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.
6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.
5) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.
4) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.
3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se alespoň jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, vyžaduje se pro validaci prvního pozitivního výsledku provedení druhého nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Jsou-li druhý nebo další testy negativní, považuje se vzorek za negativní. Další testy nejsou nutné.
2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.2.1.
1) Viz. oddíl 3.2.1., kde jsou uvedeny doporučené velikosti vzorků.

Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích rostlin bramboru nevykazujících příznaky, rostlin rajčete nevykazujících příznaky nebo rostlin jiných hostitelských rostlin nevykazujících příznaky
13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.
12) Spolehlivé identifikace čistých kultur podezřelých na R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.
11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, je třeba opakovat izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku, případně provést test s dalšími vzorky.
10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.
9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.
8) Testy ELISA jsou posány v oddíle 6.1.8.
7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.
6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.
5) Test selektivní izolace je popsán v oddíle 6.1.4.
4) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.
3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, je pro validaci prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Je-li druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za negativní. Další testy nejsou nutné.
2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.1.1.
1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použit i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.

Testování je určeno ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek alespoň ze dvou screeningových testů (viz poznámka v diagramu 3), z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogenu a dále, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je R. solanacearum. Pozitivní výsledek pouze z jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý. Screeningové testy a izolační testy musí umožnit detekční práh 10³ až 10⁴ buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.
1.2. Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru nevykazujících příznaky

2.1. Příznaky

Rychlé screeningové testy mohou napomoci předběžné diagnóze, ale nejsou dostačující. Použije se jeden nebo více následujících testů:
2.2. Rychlé screeningové testy

2.3. Postup při izolaci

2.4 Identifikační testy Ralstonia solanacearum
Testy potvrzující výskyt R. solanacearum v podezřelých izolátech jsou popsány v bodu 6.2.

3.1. Podrobné metody pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru

3.2. Podrobné metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru, rajčete nebo jiných hostitelských rostlin

4.1 Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve vodě

Princip
4.2. Metody detekce a identifikace R. solanacearum ve vodě
Validované schéma detekce popsané v tomto oddíle je použitelné k detekci patogenu ve vzorcích povrchové vody a rovněž může být použito k testování vzorků odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody. Očekávaná citlivost detekce se však liší v závislosti na substrátu. Citlivost testu selektivní izolace je ovlivňována populacemi konkurenčních saprofytických bakterií, kterých je obecně mnohem více v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě než v povrchové vodě. Zatímco níže uvedené schéma předpokládá detekci asi 10³ buněk/litr povrchové vody, citlivost detekce v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě bude pravděpodobně podstatně nižší. Z tohoto důvodu se doporučuje testovat odpadní vodu po provedení nějakého čistícího postupu (např. sedimentace nebo filtrace), při nichž dojde ke snížení saprofytických bakteriálních populací. Omezení citlivosti testovacího schématu by mělo být bráno v úvahu při hodnocení spolehlivosti v případě získání negativních výsledků.Vzhledem k tomu, že se toto schéma používá úspěšně k mapování výskytu nebo nepřítomnosti patogenu v povrchové vodě, je třeba si uvědomit jeho omezení při použití k podobnému mapování v odpadní vodě ze zpracování brambor a v odpadní vodě.

5.1. Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum v půdě

Při hodnocení spolehlivosti všech získaných negativních výsledků a také při sestavování přehledů určujících přítomnost patogenu v půdě nebo kalu je třeba vzít v úvahu omezenou citlivost tohoto testovacího schématu. Nejspolehlivějším testem přítomnosti patogenu v polní půdě je vypěstování náchylné hostitelské rostliny a její sledování, zda není infikována, ale i při použití této metody unikne nízký stupeň zamoření pozornosti.
Principy
Platné detekční schéma popsané v tomto oddíle je použitelné pro detekci patogenu ve vzorcích půdy, ale může být rovněž použito k testování vzorků pevného odpadu při zpracování brambor nebo kalu z odpadní vody. Je však nutné poznamenat, že tyto metody nejsou dostatečně citlivé, aby zaručovaly detekci nízkých nebo nepravidelně rozptýlených populací Ralstonia solanacearum, které se mohou vyskytovat v přirozeně infikovaných vzorcích těchto substrátů.
Postupový diagram a popis testů jsou v příslušném dodatku.
5.2. Metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum v půdě

6.1. Diagnostické a detekční testy

Identifikují se čisté kultury izolovaného podezřelého organismu R. solanacearum použitím nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.
6.2. Identifikační testy
Zahrnou se případně známé referenční kmeny pro každý provedený test (viz dodatek 3).

5) Provede se izolace z rostlin vykazujících příznaky odebráním segmentu ze stonku asi 2 cm nad místem inokulace. Segment se rozmělní a suspenduje v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru (dodatek 4). Izolace ze suspense se provede zřeďovacím roztěrem pokud možno na selektivní živné půdě (dodatek 2). Po inkubaci 48 až 72 hodin při teplotě 28 °C se vyhodnotí výskyt typických kolonií pro R. solanacearum.
2) Inokuluje se 5 až 10 náchylných sazenic rajčete nebo lilku ve fázi 3 pravých listů (viz odst. 6.1.9).
3) Sazenice se nechají inkubovat až 2 týdny při teplotě 25-28 °C a vysoké relativní vzdušné vlhkosti s přiměřeným zaléváním, bez vystavení zamokření nebo vyprahlosti půdy. U čistých kultur by typické vadnutí mělo nastat během 14 dnů. Neobjeví-li se po této době příznaky, kultura nemůže být považována jako patogenní forma R. solanacearum.
4) Hledají se příznaky vadnutí a/nebo epinastie, chlorózy nebo krnění.
6.3. Konfirmační test (test patogenity)
Jako závěrečné potvrzení diagnózy R. solanacearum a k potvrzení virulence kultur identifikovaných jako R. solanacearum musí být proveden test patogenity.
1) Připraví se inokulum o hustotě přibližně 10⁶ buněk na 1 ml ze 24 až 48 hodinových kultur k testování a příslušný kmen pozitivní kontroly R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3).

1. Použití jiných než výše uvedených reagencí může ovlivnit růst R. solanacearum.

2. Místo Bacto-Agar (Difco) může být použit Oxoid Agar #1. V takovém případě bude růst R. solanacearum pomalejší, ale může to také omezit růst konkurenčních saprofytů. Typické kolonie R. solanacearum se mohou tvořit o 1-2 dny déle a červené zbarvení může být světlejší a rozptýlenější než při použití Bacto-Agaru.

3. Zvýšení koncentrace bacitracinu na 2 500 U/l může omezit populace konkurenčních bakterií bez ovlivnění růstu Ralstonia solanacearum.

2.1.1. Příznaky u bramboru
Rostlina bramboru. Raná fáze infekce v polních podmínkách se rozpozná vadnutím listů směrem k vrcholu rostliny při vysokých teplotách během dne, přičemž v noci dochází k zotavení. V raných fázích vadnutí zůstávají listy zelené, ale později žloutnou a objevují se hnědé nekrózy. Dochází také k ohýbání listů dolů. Vadnutí jednoho výhonku nebo celé rostliny se rychle stává nevratným a končí kolapsem a uhynutím rostliny. Z cévních svazků napříč uříznutých stonků zvadlých rostlin obvykle vytéká hnědý a mléčný bakteriální sliz nebo je možné sliz vymáčknout. Při ponoření uříznutého stonku svisle do vody se z cévních svazků táhnou vlákna slizu.
Hlíza bramboru. Hlízy bramboru je třeba překrojit napříč u pupkového konce a podélně přes pupkový konec. V rané fázi se infekce pozná podle láhvově žlutého až světle hnědého zabarvení cévního prstence, ze kterého po několika minutách začne prýštit bledý krémový bakteriální sliz. Později se cévní zbarvení stává výrazněji hnědým a odumření se může rozšířit do parenchymatického pletiva. V pokročilejších fázích se infekce rozšíří vně od pupkového konce hlízy a z oček může vytékat bakteriální sliz, na který se přilepují částice půdy. Na slupce se mohou objevit červenohnědá, lehce propadlá místa jako důsledek vnitřního kolapsu cévního pletiva. V pokročilejších fázích infekce je obvyklý sekundární rozvoj měkkých hnilob bakteriálního a houbového původu.

Rostlina rajčete. Prvním viditelným příznakem je povadlý vzhled nejmladších listů. Za příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy kolem 25°C, při nasycené vzdušné vlhkosti) se během několika málo dní rozvine kroucení listů směrem dolů a vadnutí na jedné straně rostliny nebo celé rostliny, které končí jejím úplným odumřením. Za méně příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy méně než 21°C) rostlina tolik nevadne, ale na stonku se může tvořit větší počet postranních výhonů. Je možné pozorovat vodou nasáklé pruhy od spodu stonku, které jsou dokladem odumírání cévního systému. Při příčném řezu stonkem vylučují hnědě zbarvená vodivá pletiva bílý nebo nažloutlý bakteriální sliz.
2.1.2. Příznaky u rajčete

2.1.3. Příznaky u jiných hostitelů
Rostliny Solanum dulcamara a S. nigrum. Za normálních podmínek jsou u těchto plevelných hostitelských rostlin zřídkakdy pozorovány příznaky vadnutí, pokud teploty půdy nepřevyšují 25°C nebo není extrémně vysoká koncentrace inokula (např. u rostliny S. nigrum rostoucí u nemocné rostliny bramboru nebo rajčete). Při vadnutí jsou příznaky stejné jako u rostliny rajčete. Nevadnoucí rostliny S. dulcamara, která má stonky a kořeny ve vodě, mohou vykazovat vnitřní světle hnědé zbarvení vodivých pletiv na příčném řezu spodní části stonku nebo částí stonku pod vodou. Z řezu cévních svazků mohou vytékat bakterie nebo mohou tvořit vlákna slizu, jestliže je řez stonku ponořen svisle do vody, a to i při absenci příznaků vadnutí.

2.2.1. Test na výtok slizu ze stonku
(Viz. 6.1.1.)

2.2.2. Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu (PHB)
Charakteristické granule PHB v buňkách R. solanacearum jsou zviditelněny obarvením tepelně fixovaných skvrn bakteriálního slizu z infikovaného pletiva na mikroskopickém sklíčku nilskou modří A nebo súdánskou černí (viz. oddíl 6.1.2.).

(Viz. oddíl 6.1.3.)
2.2.3. Sérologické aglutinační testy

Dalšími vhodnými rychlými screeningovými testy jsou test IF (viz.oddíl 6.1.5.), test FISH (viz.oddíl 6.1.7.), testy ELISA (viz.oddíl 6.1.8.) a testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.).
2.2.4. Jiné testy

a) Odebere se sliz nebo vrstva zbarveného pletiva z cévního prstence hlízy bramboru nebo z cévních vláken stonku rostliny bramboru, rajčete nebo jiné vadnoucí hostitelské rostliny. Suspenduje se v malém množství sterilní destilované vody nebo 50mM fosfátového pufru (dodatek 4) a nechá se 5-10 minut stát.

b) Připraví se řada desetinásobných ředění suspenze.

c) Přenese se 50-100 μl suspenze a roztoku na universální živnou půdu (NA, YPGA neboSPA; viz. dodatek 2) a/nebo Kelmanovo tetrazolové médium (dodatek 2) a/nebo validované selektivní médium (např. SMSA, viz. dodatek 2). Rozetře se metodou zřeďovacích roztěrů. Připraví se případně samostatné misky s rozředěnou buněčnou suspenzí R. solanacearum biovar 2 k pozitivní kontrole.

- U Kelmanova tetrazolového média a média SMSA jsou spirálky krvavě červeně zbarvené. Aviruletní formy R. solanacearum tvoří malé kruhové nefluidní máslovité kolonie, které jsou zcela temně červené.
- Na universální živné půdě vytvářejí virulentní izoláty R. solanacearum perlově krémově bílé, ploché, nepravidelné a fluidní kolonie, často s charakteristickými spirálkami ve středu. Aviruletní formy R. solanacearum tvoří malé kruhové nefluidní máslovité kolonie, které jsou zcela krémově bílé.
d) Inkubuje se 2-6 dní při teplotě 28°C.

Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)
Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)
Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)
Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)
Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)
IF test (viz.oddíl 6.1.5.)
Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:
3.1.2. Testování

3.2.1. Příprava vzorků
Pro účely detekce latentních populací R. solanacearum se doporučuje testovat smíšené vzorky. Postup lze vhodně použít na smíšené vzorky o počtu až 200 stonkových částí. Provádí-li se průzkum, měl by být založen na statisticky reprezentativním vzorku zkoumané rostlinné populace.
Poznámka:

Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)
3.2.2. Testování
Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)
Test IF (viz. oddíl 6.1.5.)
Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)
Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:
Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)
Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)

(1) Viz. oddíl 4.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování.

(10) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

(2) Metody koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 4.2.1. Koncentrace zvětšuje populaci jak patogenu, tak konkurenčních saprofytických bakterií a doporučuje se jen tehdy, jestliže nebrání izolačnímu testu.

(3) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Metody obohacovacího testu PCR jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(6) Metody obohacovacího testu ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.8.

(7) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(8) Kultivace může selhat z důvodu konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření, že velká saprofytická populace ovlivní spolehlivost izolace, opakují se izolační testy po zředění vzorku sterilní vodou.

(9) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

- Vzorky vody se odebírají v blízkosti hostitelských rostlin, pokud jsou přítomny.
4.2.1. Příprava vzorků
Poznámka:
- Zjištění R. solanacearum v povrchové vodě je nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, kdy teplota vody překračuje 15°C.
- Opakované vzorkování v různé době během výše uvedených období na určených vzorkovacích místech zvýší spolehlivost zjištění snížením vlivů výkyvů povětrnostních podmínek.
- Vlivem silných dešťů a geografie vodního toku může dojít ke značnému zředění a tím i zastření výskytu patogenu.

Viz. postupový diagram a popis testů v příslušných dodatcích.
4.2.2. Testování

(1) Viz. oddíl 5.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování

(2) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(3) Obohacovací PCR testy jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(6) Kultivace může selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření na vliv saprofytické populace na spolehlivost izolace, opakují se testy selektivní izolace po dalším zředění vzorku.

(7) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

(8) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

5.2.1. Příprava vzorků

5.2.2. Testování

6.1.1. Test na výtok slizu ze stonku
Přítomnost R. solanacearum ve stoncích vadnoucích rostlin bramboru, rajčete nebo jiných hostitelských rostlin může ukázat následující jednoduchý test pravděpodobného výskytu: uřízne se stonek právě nad úrovní země. Řez stonku se ponoří do zkumavky s čistou vodou. Sleduje,se, zda se po několika minutách objeví charakteristická samovolně proudící vlákna bakteriálního slizu z přeříznutých cévních svazků.

6.1.2. Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu

6.1.3. Sérologické aglutinační testy
Aglutinace buněk R. solanacearum v bakteriálním slizu nebo v extraktech z pletiv s příznaky je nejlépe pozorovatelná pomocí validovaných protilátek (viz. dodatek 3) označených příslušnými obarvenými značkovači, např. červenými buňkami Staphylococcus aureus nebo obarvenými latexovými částicemi. Při použití komerčně dostupného vybavení (viz. dodatek 3) se postupuje podle instrukcí výrobce. Jinak je postup následující:

6.1.4. Selektivní izolace

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.
6.1.5. Test IF
Použití testu IF jako hlavního screeningového testu se doporučuje kvůli dokázané spolehlivosti v dosažení požadovaných prahů.
Použije-li se test IF jako hlavní a výsledek IF testu je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test použit test izolace, PCR nebo FISH. Jestliže je test IF použit jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.
Poznámka:
Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určit titr pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspenze obsahující 10⁵ až 10⁶ buněk/ml homologického kmene R. solanacearum a použitím vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Validovaná polyklonální antiséra mají všechna titr IF nejméně 1:2 000. Během testování by měly být použity protilátky v pracovních ředěních blízkých nebo stejných jako titr.
Test by měl být proveden na čerstvě připravených extraktech ze vzorků. Jestliže je to nutné, může být úspěšně proveden na vzorcích uchovaných při teplotě - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol může být ze vzorku odstraněn přidáním 1 ml pufru (dodatek 4), 15minutovým odstřeďováním při 7000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. Často to není potřeba, zvláště pokud jsou vzorky fixovány na sklíčka plamenem.
Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo jiným referenčním kmenem R. solanacearum suspendovaným v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B, a nepovinně v pufru.
Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě -16 až 24 °C) by se mělo podle možností použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.
Postup
Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, pokud možno s 10 okénky s průměrem nejméně 6 mm.
Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.
Jako negativní kontroly se použijí alikvotní díly extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

- reakční směs PCR.
- kontroly pufru používaného pro extrakci bakterií a DNA ze vzorku,
6.1.6. Testy PCR
Principy
- extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem,
Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:
PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:
- alikvotní části resuspendovaných pelet, do kterých byla přidána R. solanacearum (přípravu viz dodatek 3 B);
- suspenze 10⁶ buněk na 1 ml R. solanacearum ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3 B);
- pokud možno, při PCR použít také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.
S negativními kontrolami (v průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.
Aby se zabránilo případné kontaminaci, připravují se pozitivní kontroly v prostředí odděleném od vzorků, které budou testovány.
Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.
Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření k zabránění kontaminace vzorku cílovou DNA. Test PCR by měl být prováděn zkušenými laboranty v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.
Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.
Použijí se schválená činidla a protokoly PCR (viz dodatek 6). Pokud možno, zvolí se metoda s interní kontrolou.
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10³ až 10⁴ buněk R. solanacearum na 1 ml přidaný do vzorků extraktů, které byly předtím testovány jako negativní. Dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích může vyžadovat optimalizační pokusy.
Poznámka:
Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.
Použije-li se test PCR jako hlavní screeningový test a výsledek je pozitivní, musí být povinně proveden druhý screeningový test, a sice izolace nebo IF. Jestliže je PCR použita jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.

Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml R. solanacearum biovar 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 3) v 0,01M fosfátovém pufru (PB) ze 3-5 denní kultury. Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmenu nebo jiného referenčního kmene R. solanacearum, suspendovaného v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B.
6.1.7. Test FISH
Princip
Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test provedena izolace nebo IF test. Když se FISH test provede jako druhý vyšetřovací test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.
Poznámka:
Používají se schválené oligosondy specifické pro R. solanacearum (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 10³-10⁴ buněk R. solanacearum na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě - 16 až - 24 °C nebo - 68 až - 86 °C.
Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem.
Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.
Standardizovaný pozitivní a negativní kontrolní materiál, který se používá v tomto testu, je uveden v dodatku 3 bodu A.
Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako u vzorku(ů).

Vzorek, který byl předtím otestován jako R. solanacearum negativní a suspenze bakterií bez vzájemného působení v solném roztoku fosfátového pufru (PBS) se použijí jako vzorky negativní kontroly.
Negativní hodnoty ELISA v pozitivních kontrolních vzorcích ukazují, že test nebyl proveden správně nebo že byl inhibován. Pozitivní hodnoty ELISA v negativních kontrolních vzorcích ukazují, že došlo k vzájemné kontaminaci nebo nespecifickému vázání protilátek.
Test ELISA je pozitivní, jestliže průměrné hodnoty OH z jamek se stejným vzorkem jsou větší než dvojnásobek OH v negativním extraktu testovaného vzorku, pokud hodnoty OH ve všech negativních kontrolních vzorcích jsou menší než dvojnásobek hodnot v pozitivních kontrolních vzorcích.
Test ELISA je negativní, jestliže průměrná hodnota optické hustoty (OH) z jamek se stejnými vzorky je menší než dvojnásobek OH u negativního kontrolního vzorku, pokud všechny hodnoty OH pozitivních kontrolních vzorků jsou větší než 1,0 (po 90 minutách inkubace se substrátem) a jsou větší než dvojnásobek OH získané z negativních vzorkových extraktů.
Interpretace výsledků testu ELISA
6.1.8. Testy ELISA
Princip
Testy ELISA lze použít pouze jako volitelný test kromě testů IF, PCR nebo FISH pro jeho relativně nízkou citlivost. Při použití DAS ELISA je obohacení a použití monoklonálních protilátek povinné. Obohacení vzorků před použitím testu ELISA může zvýšit citlivost testu, ale může se rovněž setkat s nezdarem kvůli konkurenci jiných organismů ve vzorku.
Validované jsou dva protokoly ELISA.
Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorku(ů).
Poznámka:
Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určení titru pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspense obsahující 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml homologického kmene R. solanacearum a použití vhodných druhotných konjugátů protilátek podle doporučení výrobce. Při testování by měly být použity protilátky v pracovním ředění, které je blízké nebo stejné jako u titru komerční formulace.
Standardizované pozitivní a negativní materiály, které se používají pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3 bodu A.
Jako pozitivní kontrolní vzorky se použijí alikvótní podíly vzorkových extraktů, které byly předtím otestovány jako negativní, s příměsí 10³ až 10⁴ buněk na 1 ml biovaru 2 R. solanacearum (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 2 A a B). Pro srovnání výsledků na každé destičce se použije standardní suspenze 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml v PBS R. solanacearum. Pozitivní kontrolní vzorky musí být na mikrotitrové destičce dobře odděleny od vzorků k testování.
Určí se titr protilátek pro suspenzi 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml homologického kmene R. solanacearum.

6.1.9. Biotest
Následující protokol vychází z Janseho (1988):
Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a v optimálních růstových podmínkách. Metodu lze však také úspěšně použít na extrakty, které byly uchovány v glycerolu v teplotě - 68 až - 86 °C.
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelnou detekci 10³ až 10⁴ jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaný do extraktu ze vzorku, který byl předtím testován s negativním výsledkem (přípravu viz v dodatku 3).
Poznámka.:

Média a metody viz. Lelliot &Stead (1987).
6.2.1. Výživové a enzymatické identifikační testy
Určují se následující fenotypové vlastnosti, které jsou vesměs přítomny nebo naopak chybí u R. solanacearum, metodami Lelliott a Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Text	Očekávaný výsledek
Produkce fluorescenčního pigmentu	-
Inkluze PHB	+
Oxidačně fermentační test	O+/F-
Katalázová aktivita	+
Oxidázový test podle Kovacse	+
Redukce dusičnanů	+
Využití citrátů	+
Růst při 40°C	-
Růst v 1% NaCl	+
Růst v 2% NaCl	-
Arginin-dihydrolázová aktivita	-
Ztekucení želatiny	-
Hydrolýza škrobu	-
Hydrolýza eskulinu	-
Produkce levanu	-

6.2.2. Test IF

6.2.3. Test ELISA
Poznámka:
Při provádění pouze 2 identifikačních testů se nepoužívá kromě této metody jiný sérologický test.

6.2.4. Testy PCR

6.2.5. Test FISH

6.2.6. Analýza mastných kyselin (FAP)

6.2.7. Metody charakteristiky kmenů
Pro každý nový případ izolace R. solanacearum se doporučuje charakteristika kmenu použitím jedné z následujících metod.
U každého provedeného testu se zahrnou případně známé referenční kmeny (viz. dodatek 3).

Poznámka:
3.1.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nože na zeleninu se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy, tak aby bylo viditelné vodivé pletivo. Opatrně se vyříznou malé výkrojky vodivých pletiv na pupkovém konci. Množství pletiva nezahrnující cévní svazky se omezí na minimum.
Pokud jsou při vyříznutí výkrojku zjištěny příznaky podezření na hnědou hnilobu, provede se vizuální vyšetření takové hlízy na řezu hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se uchovávají po dobu nejméně 2 dnů při pokojové teplotě, aby mohlo dojít ke zkorkovatění (suberizaci) a potom se uchovávají v chladu (4-10°C) za řádných karanténních podmínek. Všechny hlízy včetně hlíz s podezřelými příznaky by měly být uchovány podle přílohy III.
Všechny (hnijící) hlízy s podezřelými příznaky hnědé hniloby se dají stranou a testují se odděleně.

Při homogenizaci vzorků pomocí mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutné zamezit vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakčního procesu. Pro každý vzorek se použijí čerstvě sterilované nože (ostří) a nádoby. Při testu PCR je nutno zabránit přenosu DNA na nádobách nebo v mlecím přístroji. U testu PCR se doporučuje použít drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavek na jedno použití.
nebo
3.1.1.2. Výkrojky z pupkové části se uloží do nepoužitých nádob na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že nádoby jsou znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě. Není-li to možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru; v chladu nejdéle 72 hodin nebo při pokojové teplotě (18 -25 °C) nejdéle 24 hodin.
Poznámka:
Výkrojky z pupkových konců se zpracují jedním z následujících postupů:

3.1.1.3. Supernatant se dekantuje. Je-li příliš zakalený, pročistí se buď pomalým odstřeďováním (nejvýš 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100µm), filtr se omyje přídavkem (10ml) extrakčního pufru.

3.1.1.4. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním, 7 000g po dobu 15 minut (nebo 10 000g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.

Je-li nutná přeprava extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu s doručením do 24 až 48 hodin.
Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.
3.1.1.5. Peleta se resuspenduje v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 4). Použije se 500 µl pro R. solanacearum, 500 µl pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a 500 µl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10 - 25% (v/v) k 500 µl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží se při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo -68 až -86°C (měsíce). Extrakty se uchovávají během testování při teplotě 4-10°C.

3.1.1.6. Je nezbytně nutné, aby všechny pozitivní kontroly a vzorky R. solanacearum byly uchovány a zpracovány odděleně, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci. To platí pro sklíčka IF a všechny testy.

a) Inkubace vzorků při teplotě 2-30°C po dobu až 2 týdnů před testováním na podporu množení všech populací R. solanacearum.

b) Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné desinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je vhodný zvláště v případě, když je ve vzorcích příliš zeminy nebo jestliže má být proveden test PCR nebo přímá izolace.

Jiné hostitelské rostliny: Čistým dezinfikovaným nožem nebo zahradnickými nůžkami se odebere 1 cm dlouhý díl z paty každého stonku hned nad úrovní země. U lilku potměchuti (S. dulcamara) nebo jiných hostitelských rostlin rostoucích ve vodě se odeberou 1-2 cm díly ze stonku pod vodou nebo oddenků s vodními kořeny.
Poznámka:
3.2.1.1. Do uzavřené sterilní nádoby se uloží 1-2 cm dlouhé kousky stonků podle následujícího postupu vzorkování:
Rajčatové sazenice z předpěstírny: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere kousek dlouhý 1 cm z paty každého stonku hned nad úrovní země.
V této fázi je možné provést vizuální šetření vnitřních příznaků (zbarvení cév nebo bakteriální sliz). Jakýkoli díl stonku s příznaky se dá stranou a testuje se odděleně (viz. oddíl 2.).
Rostliny z pole nebo skleníku: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere nejspodnější postranní výhonek z každé rostliny uříznutý hned nad spojením s hlavním stonkem. Odebere se nejspodnější, 1 cm dlouhý díl z každého výhonku.
Při vzorkování určité oblasti se doporučuje testovat statisticky representativní vzorek o počtu nejméně 10 rostlin na 1 vzorkovací místo pro každou potenciální plevelnou hostitelskou rostlinu. Detekce patogenu bude nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, ačkoli přirozenou infekci je možné zjistit po celý rok u víceleté Solanum dulcamara rostoucí ve vodních tocích. Mezi známé hostitelské rostliny patří plevelné rostliny bramboru, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium a další zástupci čeledi Solanaceae. Dalšími hostitelskými rostlinami jsou rostliny rodu Pelargonium spp. a Portulaca oleracea. Některé evropské plevelné druhy, které mohou hostit populace R. solanacearum biovar 2/Race 3 v kořenech a/nebo oddencích za specifických podmínek, zahrnují Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra a Urtica dioica.

3.2.1.2. Části stonku se krátce dezinfikují 70% etanolem a ihned vysuší savým papírem. Potom se zpracují části stonku jedním z následujících postupů:
nebo

3.2.1.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.

3.2.1.4. Další pročišťování extraktu nebo zahušťování bakteriální frakce obvykle není třeba, ale lze je provést filtrací a/nebo odstřeďováním popsaným v oddíle 3.1.1.3. až 3.1.1.5.

3.2.1.5. Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na dva stejné díly. Jeden díl se testuje při teplotě 4-10°C a druhý díl se skladuje v 10-25% (v/v) sterilním glycerolu při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo -68 až -86°C (měsíce) pro případné další testování.

4.2.1.2. Vzorky se přepravují v chladu a temnu (4-10°C) a testují do 24 hodin.

Koncentrace se obvykle nedoporučuje u vzorků vody ze zpracování brambor nebo u vzorků odpadní vody, protože zvýšená populace konkurenčních saprofytických bakterií inhibuje detekci Ralstonia solanacearum.
4.2.1.3. Je-li potřeba, může být provedena koncentrace bakteriální frakce pomocí následujících metod:

4.2.1.1. Na vybraných vzorkovacích místech se odeberou vzorky vody do sterilních zkumavek nebo lahviček na jedno použití, pokud možno 30 cm pod hladinou a 2 m od břehu. Při vzorkování odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody se odeberou vzorky z místa výtoku odpadní vody. Doporučená velikost vzorku je 500 ml. Je-li upřednostňována menší velikost, doporučuje se odebrat vzorky nejméně 3krát pro každé vzorkovací místo, z nichž každý bude obsahovat 2 opakované dílčí vzorky o velikosti nejméně 30 ml. Při intenzivním mapování se vyberou nejméně 3 vzorkovací místa na každé 3 km vodního toku a vzorkují se rovněž přítoky.

5.2.1.1. Vzorkování polní půdy by se mělo řídit standardními principy používanými pro vzorkování hlístů. Na jeden vzorek se shromáždí 0,5 až 1 kg půdy ze 60 míst na ploše 0,3 ha z hloubky 10-20 cm. Je-li podezření na výskyt patogenu, zvyší se počet sběrných míst na 120 z plochy 0,3 ha. Před testováním se uchovávají vzorky při teplotě 12-15°C. Kal ze zpracování brambor a kanalizace se navzorkuje shromážděním celkem 1 kg z míst reprezentujících celkový objem testovaného kalu. Před testováním se každý vzorek dobře promíchá.

5.2.1.2. Dílčí vzorky 10-25 g půdy nebo kalu se rozptýlí rotační třepačkou (250 ot./min) v 60-150 ml extrakčního pufru (dodatek 4) po dobu 2 hodin. Je-li třeba, přidání 0,02% sterilního Tween-20 a 10-20 g sterilních kamínků může napomoci disperzi.

5.2.1.3. Během testování se udržuje suspenze v teplotě 4°C.

1. Připraví se roztěr bakteriálního slizu z infikovaného pletiva nebo ze 48 hodinové kultury na živné půdě YPGA nebo SPA (dodatek 2) na mikroskopické sklíčko.

2. Připraví se pozitivní kontrolní roztěr kmenu biovaru 2 R. solanacearum a případně negativní kontrolní roztěr o známém PHB negativním sp.

3. Roztěry se nechají uschnout a spodní povrch každého sklíčka se rychle protáhne nad plamenem, aby se roztěry fixovaly.

Test súdánskou černí:
Test nilskou modří:
4. Preparáty se obarví buď nilskou modří nebo súdánskou černí a provede se mikroskopické pozorování podle níže uvedeného popisu:

a) Smíchají se kapky suspenze označené protilátky a bakteriálního slizu (přibližně 5 µl každé látky) na okénku testovacího víceokénkového sklíčka.

b) Připraví se pozitivní a negativní kontrolní vzorky použitím suspenzí biovaru 2 R. solanacearum a heterologního kmenu.

c) Pozoruje,se zda se v pozitivních vzorcích po jemném míchání po dobu 15 sekund objeví aglutinace.

6.1.4.1. Očkování na živnou půdu
Interpretace výsledků testu očkováním na selektivní média.
Při použití čerstvě připravených extraktů ze vzorků lez očekávat, že citlivost detekce touto metodou bude velmi vysoká. Metoda je však použitelná i pro extrakty, které byly uchovány v glycerolu při teplotě od -68 do -86°C.
Rozlišení R. solanacearum od jiných bakterií schopných na živné půdě růst vyžaduje velkou pozornost. Dále, kolonie R. solanacearum mohou mít atypickou morfologii, jestliže Petriho misky jsou přeplněny nebo jsou rovněž přítomny antagonistické bakterie. Je-li podezření na konkurenci nebo inhibici, měl by být vzorek otestován znovu pomocí jiného testu.
Někdy se na tomto médiu tvoří atypické kolonie R. solanacearum. Mohou být malé, kruhové, zcela červené a nefluidní nebo jen částečně fluidní, a proto obtížně rozeznatelné od saprofytických bakterií tvořících kolonie.
Pozitivní kontroly se připraví jako desetinné ředění ze suspenze 10⁶ cfu/ml virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762= CFBP 3857). K vyloučení možné kontaminace se připraví pozitivní kontrolní vzorky zcela odděleně od vzorků k testování.
Poznámka:
U každé nově připravené šarže selektivní živné půdy by měla být před jejím použitím k rutinnímu testování vzorků nejdříve otestována její vhodnost pro kultivaci patogenu. Kontrolní materiál se testuje týmž způsobem jako vzorek (vzorky).
Poznámka:
Než se použije tato metoda poprvé, provede se předběžný test k zajištění reprodukovatelné detekce 10³ až 10⁴ jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaných do extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Test očkování na selektivní média je pozitivní, jestliže jsou izolovány podezřelé kolonie R. solanacearum.
Použije se řádně validovaná selektivní živná půda, např. SMSA (ve znění Elphinstone et al., 1996; viz. dodatek 2).
Test očkování na selektivní média je negativní, jestliže po 6 dnech nejsou zpozorovány žádné bakterie nebo nejsou nalezeny žádné podezřelé kolonie typické pro R. solanacearum, za předpokladu, že nedošlo k inhibici jinými bakteriemi a v kontrolních vzorcích jsou nalezeny typické kolonie R. solanacearum.

Použije se validované médium pro obohacení, např. modifikovaný bujón Wilbrink (viz dodatek 2).
Tento postup lze použít pro selektivní zvětšení populací R. solanacearum v extraktech ze vzorků a zvýšení citlivosti detekce. Tímto způsobem dojde i ke zředění potenciálních inhibitorů PCR testu (1:100). Obohacení R. solanacearum však může být neúspěšné z důvodů konkurence nebo antagonismu saprofytických organismů, které bývají často současně také obohaceny. Z tohoto důvodu může být izolace R. solanacearum z obohacené kultury obtížná. Kromě toho, protože může dojít k rozvoji populací sérologicky příbuzných saprofytů, se pro test ELISA doporučuje použít místo polyklonálních protilátek specifické monoklonální protilátky.
Poznámka:
Očekává-li se inhibice obohacení R. solanacearum z důvodu vysoké koncentrace konkurenčních saprofytických bakterií, lze docílit lepších výsledků obohacením extraktů ze vzorků před jakýmkoli odstřeďováním nebo jinými postupy zvyšování koncentrace.
6.1.4.2. Obohacovací testy

Napipetuje se odměřené standardní množství (15 µl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované bramborové pelety v ředění 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhá řada může být použita jako duplikát nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr. 1.
i) Pro pelety s relativně nízkým množstvím sedimentu škrobu:
6.1.5.1. Připraví se sklíčka k testování jedním z následujících postupů:
ii) Pro jiné pelety:
Připraví se desetinná ředění (1/10, 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se odměřené standardní množství (15 µl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované pelety pro každé ředění do řady okének. Druhá řada může být použita jako rezervní nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr.2.

6.1.5.2. Vysuší se kapičky při okolní teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C), plamenem, 95 % etanolem nebo podle konkrétních instrukcí od dodavatele protilátek.
Pokud je potřeba, fixovaná sklíčka je možné skladovat ve zmrazeném stavu v suchém boxu po nezbytně krátkou dobu (maximálně 3 měsíce) před dalším testováním.

Obrázek 1. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.i) a 6.1.5.3.i)
Pracovní ředění antitiséra/protilátky


Ředění resuspendované pelety
i) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.i):
Připraví se pracovní ředění (PŘ) protilátek v pufru IF. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.
Připraví se sada dvojnásobných zředění. První jamka by měla mít ¹/₂ titru (T/2), ostatní ¹/₄ titru (T/4), ¹/₂ titru (T/2), titr (T) a dvojnásobek titru (2T).
ii) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.ii):
Obrázek 2. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.ii) a 6.1.5.3.ii)
6.1.5.3. Postup IF

6.1.5.4. Vyhodnocení IF testu

Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.
Používají se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky (viz. dodatek 3).
K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymových reakcí a koncentrující cílovou DNA ve vzorku. Následující metoda byla optimalizována pro použití se schválenými metodami PCR uvedenými v dodatku 6.
6.1.6.1. Metody purifikace DNA

6.1.6.2. PCR

Interpretace výsledků testu PCR
Test PCR je pozitivní, jestliže je zjištěn amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti a (případně) vzoru, za předpokladu, že není amplifikován u žádného vzorku negativní kontroly. Spolehlivé potvrzení pozitivního výsledku lze také získat opakováním testu s druhou sadou primerů PCR dodatek 6).
Test PCR je negativní, jestliže amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti není u zkoumaného vzorku zjištěn, ale je zjištěn u všech pozitivních kontrolních vzorků (v případě vícenásobné PCR s interními kontrolními primery specifickými pro rostlinu: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován se zkoumaným vzorkem).
V případě, že očekávaný amplikon je získán z jednoho nebo více vzorků negativních kontrol, je podezření na kontaminaci.
Poznámka:
Lze mít podezření na inhibici PCR, jestliže je získán očekávaný amplikon ze vzorku pozitivní kontroly obsahujícího R. solanacearum ve vodě, zatímco ze vzorku pozitivní kontroly R. solanacearum v bramborovém extraktu byly získány negativní výsledky. V multiplexních protokolech PCR s interními kontrolami PCR nasvědčuje inhibici reakce, jestliže není získán žádný ze dvou amplikonů.
6.1.6.3. Analýza produktu PCR

Následující protokol vychází z Wullingse et al. (1998).
6.1.7.1. Fixace bramborového extraktu

6.1.7.2. Hybridizace

6.1.7.3. Hodnocení FISH testu

7) Roztok protilátek se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4.).
8) Připraví se vhodné ředění konjugátu alkalické fosfatázy v blokačním pufru. Přidá se 100 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.
9) Konjugát se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4).
1) Použije se 100-200 µl vzorkového extraktu. (Zahřátí na 100 °C na 4 minuty ve vodní lázni nebo topném boxu může v některých případech redukovat vznik nespecifických výsledků).
2) Přidá se stejné množství dvojnásobně silného uhličitanového krycího pufru (dodatek 4) a směs se promíchá.
3) Nakape se 100 µl do každé jamky mikrotitrační destičky (např. Nunc-Polysorp nebo rovnocenné) a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C nebo 14 – 18 h při teplotě 4 °C.
4) Extrakty se vylijí z jamek. Jamky se třikrát vymyji pomocí PBS-Tween (dodatek 4) a poslední vymývací roztok se nechá v jamce nejméně 5 minut.
5) Připraví se vhodné ředění protilátek proti R. solanacearum v blokačním pufru (dodatek 4). U validovaných komerčních protilátek se použijí doporučená ředění (obvykle dvojnásobné koncentrace, než je titr).
6) Přidá se 100 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.
10) Přidá se 100 µl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatek 4) do každé jamky. Nechá se inkubovat v temnu při pokojové teplotě a odečítá se absorbance při 405 nm v pravidelných 90minutových intervalech.
a) Nepřímý test ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

3) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
6) Připraví se ředění protimyšího imunoglobulinu konjugovaného alkalickou fosfatázou v PBS. Přidá se 190 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 2 hodiny při teplotě 37 °C.
2) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).Přidá se 190 µl extraktu ze vzorku do nejméně dvou jamek. Přidají se rovněž pozitivní a negativní kontrolní vzorky do dvou jamek na každé destičce. Nechá se inkubovat 16 hodin při teplotě 4 °C.
7) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
1) Připraví se vhodné ředění polyklonálního imunoglobulinu v uhličitanovém pufru pH 9.6 (dodatek 4). Přidá se 200 µl do každé jamky. Nechá se inkubovat při teplotě 37 °C 4 až 5 hodin nebo 4 ° C po dobu 16 hodin.
b) DAS-ELISA
8) Připraví se roztok 1 mg p-NPP/ml alkalické fosfatázy v substrátovém pufru (dodatek 4). Přidá se 200 µl do každé jamky a inkubuje se v temnu při pokojové teplotě. Absorbance při 405 nm se odečítá v pravidelných intervalech 90 minut.
5) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
4) Připraví se vhodné ředění specifických monoklonálních protilátek R. solanacearum v PBS (dodatek 4) s obsahem 0,5 % hovězího sérového albuminu (BSA), přidá se 190 µl do každé jamky a nechá stát 2 hodiny při teplotě 37 °C.

6.1.9.1. Použije se 10 testovacích rostlin citlivé odrůdy rajčete (např. kultivaru Moneymaker nebo kultivaru s rovnocennou citlivostí podle testovací laboratoře) ve fázi třech pravých listů u každého vzorku. Podrobnosti pěstování viz. v dodatku 8. Nebo se použije lilek (např. kultivar Black Beauty nebo kultivary s rovnocennou citlivostí), ale jen rostliny ve fázi 2. až 3. listů až do plného rozvinu třetího pravého listu. Příznaky u lilku jsou méně výrazné a vyvíjejí se pomaleji. Pokud možno, doporučujeme proto použít sazenice rajčat.

6.1.9.2. Rozdělí se 100 µl extraktu ze vzorku mezi testovací rostliny.

6.1.9.3. Stejnou technikou se nainokulujte 5 sazenic vodní suspenzí 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml, připravenou ze 48 hodinové kultury virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum jako pozitivní kontrolní vzorek, a peletovým pufrem (dodatek 4) jako negativní kontrolní vzorek. Oddělí se pozitivní a negativní kontrolní rostliny od ostatních rostlin, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci.

6.1.9.4. Testovací rostliny se nechají růst v karanténním zařízení 4 týdny při teplotě 25 -30 °C a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným zavlažováním, aby se zabránilo jak přemokření, tak vadnutí z důvodu nedostatku vody. Aby se zabránilo kontaminaci, musí být drženy pozitivní a negativní kontrolní rostliny ve zcela oddělených místech skleníku nebo vegetační komory nebo jinak přísně izolovány. Musejí-li být rostliny z různých vzorků po dobu inkubace drženy blízko sebe, oddělí se vhodnými zástěnami. Při hnojení, zalévání, prohlížení a všech ostatních činnostech se věnuje zvláštní pozornost tomu, aby nedošlo k vzájemné kontaminaci. Nutné je udržovat skleník nebo vegetační prostor bez hmyzích škůdců, protože by mohli přenést bakterie mezi vzorky.
Hledají se příznaky vadnutí, epinastie, chloróz anebo krnění rostlin.

6.1.9.5. Z infikovaných rostlin se provede izolace (odst. 2.3) a identifikují se podezřelé čisté kultury (bod 6.2.).

6.1.9.6. Jestliže během 3 týdnů nejsou pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR/izolace na složeném vzorku ze segmentů stonků dlouhých 1 cm z každé testovací rostliny, odebraných nad místem inokulace. Je-li test pozitivní, provedou se zřeďovací roztěry (bod 4.1).

Biotest je pozitivní, jestliže testovací rostliny jsou infikovány bakteriemi R. solanacearum.
6.1.9.7. Identifikují se všechny čisté kultury s podezřením na R. solanacearum (bod 6.2.).
Biotest je negativní, jestliže rostliny nejsou infikovány bakteriemi R. solanacearum, pokud byl organismus zjištěn u pozitivních kontrolních testovacích rostlin.
Platné výsledky biotestu jsou získány, jestliže pozitivní kontrolní testovací rostliny vykazují typické příznaky, bakterie mohou být z těchto rostlin znovu izolovány a negativní kontrolní rostliny nevykazují žádné příznaky.
Interpretace výsledků biotestu

6.2.2.1. Připraví se suspenze přibližně 10⁶ buněk na 1 ml v pufru IF (dodatek 4).

6.2.2.2. Připraví se řada dvojnásobných zředění vhodného antiséra.

6.2.2.3. Použije se IF metoda (6.1.5.).

6.2.2.4. Test IF je pozitivní, jestliže titr IF kultury odpovídá titru pozitivní kontroly.

6.2.3.1. Připraví se suspenze přibližně 10⁸ buněk na 1 ml v 1X PBS (dodatek 4).

6.2.3.2. Provede se test ELISA se specifickou monoklonální protilátkou k R. solanacearum.

6.2.3.3. Test ELISA je pozitivní, jestliže hodnota jeho výsledku získaná z této kultury je nejméně poloviční v porovnání s hodnotou z pozitivní kontroly.

6.2.4.1. Připraví se suspenze přibližně 10⁶ buněk na 1 ml sterilní vody (UPW = ultra pure water).

6.2.4.2. Ohřeje se 100 µl buněčné suspense v uzavřených zkumavkách v ohřívacím bloku nebo vařící vodní lázni při 100 °C 4 minuty. Vzorky mohou být uchovány při teplotě - 16 až - 24 °C do dalšího použití.

6.2.4.3. Použijí se příslušné postupy PCR k amplifikaci amplikonů specifických pro R. solanacearum (např. Seal et al. (1993); Pastrik a Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

6.2.4.4. Identifikace organismu R. solanacearum je pozitivní, jestliže amplikony PCR mají stejnou velikost a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentů jako pozitivní kontrolní kmen.

6.2.5.1. Připraví se suspenze přibližně 10⁶ buněk na 1 ml v UPW.

6.2.5.2. Použije se metoda FISH (6.1.7) s nejméně 2 oligosondami specifickými pro R. solanacearum (dodatek 7).

6.2.5.3. Test FISH je pozitivní, jestliže se u kultury a pozitivní kontroly dosáhne stejných reakcí.

6.2.6.1. Pěstuje se kultura na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) 48 hodin při teplotě 28 °C.

6.2.6.2. Použijte se metoda FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.2.6.3. Test FAP je pozitivní, jestliže je profil podezřelé kultury stejný jako profil pozitivní kontroly. Výskyt charakteristických mastných kyselin: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH a absence 16:0 3 OH poukazuje na Ralstonia sp.

R. solanacearum tvoří biovary lišící se schopností využití a/nebo oxidace tří disacharidů a tří hexosových alkoholů (Hayward, 1964 a Hayward et al., 1990). Živná půda pro test biovaru je popsána v dodatku 2. Test lze úspěšně provést očkováním do živné půdy s čistou kulturou R. solanacearum a inkubací při teplotě 28 °C. Je-li živná půda rozdělena na sterilní destičky s 96 jamkami (200 µl na 1 jamku), zbarvení se mění během 72 hodin od olivově zelené po žlutou a znamená pozitivní výsledek testu.

Dodatečné testy pro rozlišení dílčích fenotypů biovaru 2
6.2.7.1. Stanovení biovaru

6.2.7.2. Genomická variabilita
Molekulární identifikace kmenů komplexu R. solanacearum lze dosáhnout několikerými technikami, mezi něž patří:

6.2.7.3. Metody PCR
Specifické primery PCR (Pastrik et al, 2002; viz dodatek 6) lze použít k diferenciaci kmenů patřících do skupiny 1 (biovary 3, 4 a 5) a skupiny 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum, jak bylo původně definováno analýzou RFLP (Cook et al., 1989) a sekvenováním 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).

a) Zalijí se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) a třepou se v rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny při teplotě nižší než 24 °C nebo 16-24 hodin chlazené,

b) homogenizují se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) buď v mixéru (např. Waring nebo Ultra Thurax) nebo drcením v utěsněném maceračním sáčku na jedno použití (např. silný polyethylenový sáček Stomacher nebo Bioreba, 150mm × 250mm, sterilovaný zářením) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex).

a) zalijí se části dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) a třepou na rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny při teplotě do 24°C nebo 16-24 hodin chlazené,

b) se ihned zpracují drcením v pevném maceračním sáčku (např. Stomacher nebo Bioreba) s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 4) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex). Není-li to možné, uloží se části stonků v chladu nejdéle na 72 hodin nebo při pokojové teplotě (18 – 25°C) na 24 hodin.

a) Odstřeďují se 30-50 ml dílčí vzorky při 10 000 g po dobu 10 minut (nebo 7000 g po dobu 15 minut), pokud možno při teplotě 4-10°C, slije se kapalina nad usazeninou a resuspenduje se peleta v 1 ml pufru (dodatek 4).

b) Provede se filtrace přes membránu (minimální velikost pórů 0,45 µm) s následným promytím filtru v 5-10 ml peletového pufru a zachycením filtrátu. Tato metoda je vhodná pro velké objemy vody, které obsahují malý počet saprofytů.

a) Obě sklíčka se zakápnou 1% vodným roztokem nilské modři a nechají se inkubovat 10 minut při teplotě 55°C.

a) Zakápnou se všechna sklíčka 0,3% roztokem súdánské černi B v 70% etanolu a inkubují se 10 minut při pokojové teplotě.

b) Odstraní se barvící roztok. Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.

b) Odstraní se barvící roztok a krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku a odsaje se přebytečná voda savým papírem.

c) Roztěr se zakápne 8% vodním roztokem kyseliny octové a nechá se inkubovat 1 minutu při pokojové teplotě.

c) Sklíčka se ponoří krátce do xylolu a vysají se savým papírem. Upozornění: Xylol je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.

d) Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.

d) Sklíčka se zakápnou 0,5% (w/v) vodným roztokem safraninu a nechají 10 vteřin inkubovat při pokojové teplotě. Upozornění: safranin je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.

e) Znovu se navlhčí kapkou vody a přiloží se krycí sklíčko.

e) Sklíčka se opláchnou jemně tekoucí vodou z kohoutku, odsaje se přebytečná voda savým papírem a přiloží se krycí sklíčko.

f) Zkoumá se obarvený roztěr epifluorescenčním mikroskopem při 450 nm pod olejovou nebo vodní imersí se zvětšením 600× až 1000× s použitím objektivu pro olejovou nebo vodní imersi.

f) Zkoumá se obarvený roztěr mikroskopem s procházejícím světlem pod olejovou imersí a při zvětšení 1 000×.

g) Pozoruje se, zda se objeví na PHB granulích jasně oranžová fluorescence. Také se pozoruje v procházejícím normálním světle, zda jsou granule intracelulární a zda je morfologie buněk typická pro R. solanacearum.

g) Hledá se modročerné zbarvení PHB granulí v buňkách R. solanacearum s růžově zbarvenými stěnami buněk.

1. Provede se ředění s cílem zajistit, aby všechny populace saprofytických bakterií byly vyloučeny. Nanese se 50-100 µl extraktu vzorku na 1 misku pro každé ředění.

2. Misky se nechají inkubovat při teplotě 28°C. Po 48 hodinách se zkontroluje jejich stav a pak se provádí kontrola denně po 6 dní. Typické kolonie R. solanacearum na živné půdě SMSA jsou mléčně bílé, ploché, nepravidelné a fluidní a po 3 dnech inkubace se rozvine růžově až krvavě červené zbarvení ve středu s vnitřními pruhy nebo spirálami.

3. Předpokládané kolonie R. solanacearum se rozetřou nebo očkují metodou zřeďování na universální živnou půdu, aby se získaly izolované kolonie (viz. dodatek 2).

4. Kultury se uchovávají krátkodobě ve sterilní vodě (pH 6-8, bez chlóru) při pokojové teplotě v temnu nebo dlouhodobě ve vhodném ochranném médiu při teplotě -68 až -86°C nebo lyofilizované.

5. Provede se identifikace podezřelých kultur (viz. oddíl 6.2.) a test patogenity (viz oddíl 6.3).

1. U obohacovacího testu PCR se přenese 100 ul extraktu ze vzorku do 10 ml obohaceného bujónu (dodatek 2), který se předem připraví do sterilních zkumavek nebo baněk. U obohacovacího testu ELISA může být použit větší podíl extraktu ze vzorku do bujónu (např. 100 ul v 1,0 ml obohacené živné půdy).

2. Inkubuje se 72 hodin při teplotě 27 až 30 °C v třepané nebo statické kultuře s uvolněnými uzávěry, které umožní provzdušňování.

3. Před zahájením testů ELISA nebo PCR se obsah dobře promíchá.

4. S obohaceným bujónem se zachází týmž způsobem jako se vzorky ve výše uvedených testech.

Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:
1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený savý papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.

2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25°C).

3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 4) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci. Pečlivě se odstraní přebytečná vlhkost jemným osušením.

4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.

5. Sklíčka se inkubují zakrytá na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25°C).

6. Setřesou se kapky konjugátu ze sklíčka. Sklíčko se opláchne a umyje jako předtím (3.).
Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.

7. Napipetuje se 5-10 ul 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 4) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží se krycí sklíčko.

Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (odst. 6.1.5).
1. Prohlížejí se testovací sklíčka epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500x až 1 000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.

2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií R. solanacearum v testovacích okéncích sklíčka. Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.
Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou R. solanacearum.

4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 6.1.5.3.

i) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 5).
ii) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než 5 × 10³ buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.
Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně 5 × 10³. Vzorek je považován za potenciálně infikovaný a je povinné další testování.
5. Interpretace výsledků testu IF:

a) Metoda podle Patrika (2000)

b) Jiné metody
Jiné metody extrakce DNA, např. Qiagen DNeasy Plant Kit, by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10³ až 10⁴ patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle schválených protokolů (6.1.6). Připraví se desetinásobné ředění vzorku extraktu DNA (1:10 ve sterilní vodě).

2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, ve kterém nehrozí kontaminace podle zveřejněných protokolů (dodatek 6). Pokud možno, doporučuje se použít multiplexní protokol PCR, který rovněž zahrnuje interní protokol PCR.

3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 µl extraktu DNA na 25 µl PCR reakce podle protokolů PCR (viz dodatek 6).

4. Přidají se negativní kontrolní vzorky obsahující pouze reakční směs PCR a přidá se týž zdroj UPW jako byl ten, který byl použit ve směsi PCR místo vzorku.

5. PCR mikrozkumavky se umístí do téhož termocykleru, který byl použit při počátečním testování, a spustí se vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6).

1. Amplikony se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 µl směsi amplifikované DNA z každého vzorku s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Tris-acetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V/cm. Použije se vhodný DNA marker, např. (ladder) 100 bp.

2. Detekují se proužky DNA obarvením v ethidiumbromidu (0,5 mg/l) po dobu 30-60 minut za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.

4. U všech nových nálezů/případů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a čase shodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Naštěpené fragmenty se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčních fragmentů pod UV světlem po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.

1 Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7).

2. Napipetuje se 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďuje se po dobu 7 minut na 7 000 g.

3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta ve 200 µl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje 1 hodinu v chladícím zařízení.

4. Odstřeďuje se 7 minut při 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 µl 0,01M PB (viz dodatek 7).

Obrázek 7.1 Rozmístění na sklíčku FISH
5. Kápne se 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 7.1, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49 µl) může být uložen při teplotě - 20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním a přidá se stejné množství 0,01 PB (zamíchá se protřepáním).

6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo v sušičce sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.
V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.

1. Dehydratují se buňky v postupné etanolové řadě 50 %, 80 % a 96 %, pokaždé po dobu 1 minuty. Osuší se vzduchem v držáku sklíček.

2. Připraví se vlhká inkubační komora přikrytím dna vzduchotěsného boxu tkaninou nebo filtračním papírem nasáklým hybridizační směsí (1x hybmix, dodatek 7). Před inkubací se ohřeje box v hybridizační peci při teplotě 45 °C po dobu nejméně 10 minut.

3. Použije se 10 µl hybridizačního roztoku (dodatek 7) na 8 okének (okénka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 a 10; viz obr.7.1) na každém sklíčku, přičemž dvě středová okénka (3 a 8)se nechají prázdná.

4. Přiloží se krycí sklíčka (24 x 24 mm) na první a poslední 4 okénka, a to tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předem zahřáté vlhké komory a nechá se proběhnout proces hybridizace po dobu 5 hodin v troubě při teplotě 45 °C v temnu.

5. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l vody s molekulární kvalitou (Milli Q), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix a 666 ml vody s molekulární kvalitou) a 1 l 1/8x hybmixu (42 ml 3x hybmix a 958 ml vody s molekulární kvalitou). Nechají se inkubovat ve vodní lázni o teplotě 45 °C.

6. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku sklíček.

7. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1 x hybmixem při teplotě 45°C.

8. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku 1/8 hybmix a nechá se inkubovat dalších 15 minut.

9. Sklíčka se krátce ponoří do UPW (např. Milli Q water) a položí na filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetuje se 5-10 µl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každého okénka a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).

1. Sklíčka se ihned prohlížejí pod mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630 x nebo 1 000 x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky(včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky R. solanacearum obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (odst. 6.1.7) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlížejí se okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí mikroskopu.

2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro R. solanacearum v okénkách testovacích sklíček. Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.

3. Při podezření na jakoukoli kontaminaci musí být test opakován. To může nastat v případě, kdy všechna sklíčka ve várce ukazují pozitivní buňky z důvodu kontaminace pufru nebo jestliže jsou pozitivní buňky zjištěny (vně okénka sklíčka) na krytu sklíčka.

4. Specifičnost testu FISH s sebou nese několik problémů. Je pravděpodobné, že u pletiv z bramborových hlíz a pelet ze stonkových partií bramboru dojde k výskytu populací fluorescenčních buněk na pozadí s atypickou morfologií a ke křížové reakci se saprofytickými bakteriemi velikostí a morfologií podobnými R. solanacearum, i když mnohem méně častěji než u testu IF.

5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií.

6. Interpretace výsledků testu FISH
ii) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.
i) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň 5 x 10³ typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než 5 x 10³ typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.

1. Inokulace injekční stříkačkou
Inokulují se stonky rostlin hned nad děložními listy pomocí stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23G). Vzorek se rozdělí mezi testovací rostliny.

Řez se utěsní sterilní vazelínou z injekční stříkačky.
Rostlina se přidrží mezi dvěma prsty a pipetou se kápne přibližně 5-10 µl suspendované pelety na stonek mezi děložními listy a prvním listem.
2. Inokulace zářezem
Sterilním skalpelem se udělá příčný řez asi 1 cm dlouhý a hluboký přibližně 2/3 tloušťky stonku, přičemž řez se začne v místě kapky resuspendované pelety.

1. Analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů RFLP (Cook et al., 1989).

2. Repetitivní sekvenční PCR s využitím primerů REP, BOX a ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

3. Analýza délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů AFLP (Van der Wolf et al., 1998).

1. Napipetuje se 220 µl lyzátového pufru (100mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)) do 1,5 ml Eppendorfovy mikrozkumavky.

10. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (- 20 °C), krátce promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 min.

11. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C a odstraní se etanol z pelety.

12. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (- 20 °C) a promíchá se překlápěním mikrozkumavky.

13. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C, zachová se peleta a odstraní etanol.

14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA odparce.

15. Peleta se resuspenduje v 100 µl sterilní UPW a nechá se stát při pokojové teplotě nejméně 20 minut.

16. Skladuje se při teplotě - 20 °C až do použití při PCR.

17. Jakákoliv bílá sraženina se odstraní odstředěním. 5 µl supernatantu obsahujícího DNA se použije pro test PCR.

2. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a mikrozkumavka se umístí do termobloku nebo vodní lázně s teplotou 95 °C na 10 min.

3. Mikrozkumavka se vloží na 5 min. do ledu.

4. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lysozymu (50 mg lysozymu/na 1 ml 10 mM TrisHCl, pH 8,0) a inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

5. Přidá se 220 µl roztoku Easy DNA® A (Invitrogen), dobře promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.

6. Přidá se 100 µl roztoku Easy DNA® B (Invitrogen), důkladně promíchá třepáním, pokud vzorek nezačne být stejnoměrně viskózní.

7. Přidá se 500 µl chloroformu a promíchá, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.

8. Pro oddělení fází a vytvoření mezifáze se směs odstřeďuje při 15 000 g po dobu 20 min. při teplotě 4 °C.

9. Horní fáze se převede do nové Eppendorfovy mikrozkumavky.

2. Diagnóza původce hnědé hniloby

3. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vzorcích hlíz bramboru

4. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vodě

5. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby v půdě

6. Optimalizované protokoly pro detekci a identifikaci R. solanacearum

Kelmanovo tetrazoliové médium
kasein hydrolyzát (Difco)	1,0 g
Bacto-Pepton (Difco)	10,0 g
Dextróza	5,0 g
Bacto-Agar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Ochladí se na 50 °C a přidá se filtrem sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.
Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Sacharózopeptonový agar (SPA)
Sacharóza	20,0 g
Bacto-Peptone (Difco)	5,0 g
K2 HPO4	0,5 g
MgSO4 . 7H2O	0,25 g
Bacto-Agar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l
pH 7,2–7,4

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
a) Živné půdy pro izolaci a kultivaci
Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)
Kvasnicový extrakt (Difco)	5,0 g
Bacto-Pepton (Difco)	5,0 g
D(+) Glukóza (monohydrát)	10,0 g
Bacto-Agar (Difco)	15,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Živný agar (NA)
Živný agar (Difco)	23,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

A. Komerční standardizovaný kontrolní materiál

Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH
Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná hustota přibližně 2 × 10⁸ buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.
Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum.
Zpracují se pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.
Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 µl resuspendované pelety.
Přenese se 100 µl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a protřepe se..
Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.
Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.
Připraví se alikvotní části z 100 µl ve sterilních zkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se při teplotě - 16 až - 24 °C až do doby použití.
Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejprve potvrzeny testem IF.
Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v 10⁶ a 10⁴ buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.

1. Pufry pro extrakci

Pufr pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)
2. Pufry pro IF test
Tento pufr se používá k ředění protilátek.

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4 . 2H2O	0,4 g
NaCl	8,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.
IF-pufr-Tween
Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček.
Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.
Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6
Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.

Na2HPO4 .12H2O	3,2 g
NaH2PO4 . 2H2O	0.15 g
Glycerol	50 ml
Destilovaná voda	100 ml

Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield^® (Vector Laboratories) nebo Citifluor^® (Leica).

3. Pufry pro účely nepřímého testu ELISA

4. Pufry pro účely testu DASI ELISA

1. Protokol PCR Seal et al. (1993)

2. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)

3. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al., 2002)

4. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)

5. Příprava nanášecího pufru

TRIS	48,4 g
Ledová kyselina octová	11,42 ml
EDTA (sodná sůl)	3,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).
Před použitím se zředí na 1X.
6. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0

Sonda specifická pro R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
1. Oligosondy

iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water = (UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
2. Fixační roztok
[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ. POUŽÍT RUKAVICE A NEVDECHNOUT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]
ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. [UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ PH!]

Zředí se až 1x, podle potřeby.
3. 3x Hybmix

NaCl	2,7 M
Tris-HCl	60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)	15 mM

Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl hybridizačního roztoku.UPOZORNĚNÍ: FORMAMID JE VELMI JEDOVATÝ, NUTNO POUŽÍVAT RUKAVICE A UČINIT POTŘEBNÁ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ!

1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS)	0,01 %
Formamid	30 %
Sonda EUB 338	5 ng/µl
Sonda OLI-1 nebo OLI2	5 ng/µl

Poznámka:
Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití se chrání před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.

Počet sklíček	1	4	6	8	10
Sterilní ultra čistá voda	23,1	92,4	138,6	184,8	231,0
3 x Hybmix	30,0	120,0	180,0	240,0	300,0
1 % SDS	0,9	3,6	5,4	7,2	9,0
Formamid	27,0	108,0	162,0	216,0	270,0
Sonda EUB 338 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/µl)	4,5	18,0	27,0	36,0	45,0
Celkové množství	90,0	360,0	540,0	720,0	900,0

4. Hybridizační roztok

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0

Na2HPO4	8,52 g
KH2PO4	5,44 g
Destilovaná voda	1,00 l

3.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
Poznámka:

1 cyklus:	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
	iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
	iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
	vi) nechá se při teplotě 4 °C.

3.4. Restrikční enzymová analýzy amplikonu
Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C.

Reverzní primer Rs-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Reverzní primer Rs-3-R: 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:
Přímý primer Rs-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp
4.1. Oligonukleotidové primery

4.2. Reakční směs PCR

Poznámka:
4.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro biovary 1/2- a biovary 3/4/5:

1 cyklus:	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
	iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
	iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
	vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.
Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají žádná restrikční místa.

Bromfenolová modř	5g
Destilovaná (redestilovaná) voda	50 ml

5.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)

Glycerol (86 %)	3,5 ml
Bromfenolová modř (5,1)	300 µl
Destilovaná (redestilovaná) voda (bidestilát)	6,2 ml

5.2. Nanášecí pufr

16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

s = plocha pole objektivu.
kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více okénky a
$\mathrm{s}={\mathrm{\pi }}^2/4{\mathrm{G}}^2{\mathrm{K}}^2,$
$\mathrm{C}=\mathrm{c}\times \mathrm{S}/\mathrm{s},$
G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).
kde i = koeficient pole (v rozmezí 8 – 24 podle typu okuláru),
K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),
2. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku mikroskopického sklíčka (C).

22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

1. Národní sbírka patogenních bakterií rostlin (NCPPB), Ústřední vědecká laboratoř York, UK.

2. Sbírka kultur sekce ochrany rostlin (PD), Wageningen, Nizozemsko.

3. Francouzská sbírka patogenních bakterií rostlin (CFBP), Ústav fytobakteriologie INRA, Angers, Francie.

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	12,925 µl
10x pufr PCR(1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Primer Rs-1-R (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Taq polymeráza (5U/µl)(1)	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

a) Protokol PCR specifický pro biovar ¹/₂

b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	14,925 µl
10x pufr PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 µM)	1,0 µl	0,4 µM
Primer Rs-3-R (10 µM)	1,0 µl	0,4 µM
Taq polymeráza (5U/µl) (1)	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1)Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

F = zřeďovací faktor resuspendované pelety
3. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).
$\mathrm{N}=\mathrm{C}\times 1000/\mathrm{y}\times \mathrm{F},$
kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a

3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105;373-380.

4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).

Poznámka:
a) Izolované bakteriální kultury
Následující izolované bakteriální kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2). Všechny kmeny jsou komerčně dostupné a lze je získat z těchto sbírek:
Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum

Kód NCPPB	SMT #	Jiné kódy	Identifikace
NCPPB 4162	51	CFBP 1954	Bacillus polymyxa(1)
NCPPB 4163	52	CFBP 1538	Pseudomonas marginalis pv. marginalis(1)
NCPPB 4164	-	CFBP 2227	Burkholderia cepacia (2)
NCPPB 4165	-	CFBP 2459	Ralstonia pickettii(2)
NCPPB 4166	58	CFBP 3567, CSL Pr1150	Ralstonia pickettii(1)
NCPPB 4167	60	CFBP 4618, PD 2778	Ralstonia sp. (1)
NCPPB 1127	53	CFBP 3575	Burkholderia andropogonis (1)
NCPPB 353	54	CFBP 3572	Burkholderia caryophylli(1)
NCPPB 945	55	CFBP 3569	Burkholderia cepacia (1)
NCPPB 3708	56	CFBP 3574	Burkholderia glumae (1)
NCPPB 3590	57	CFBP 3573	Burkholderia plantarii (1)
NCPPB 3726	59	CFBP 3568	Banana Blood Disease Bacterium (1)(2)(3)
NCPPB 4168	61	CFBP 4619, IPO S339	Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4169	62	IPO 1695	Enterobacter sp. (1)
NCPPB 4170	63	CFBP 4621, IPO S306	Ochrobactrum anthropi(1)(2)
NCPPB 4171	64	CFBP 4622, IPO 1693	Curtobacterium sp.(1)(2)
NCPPB 4172	65	IPO 1696a	Pseudomonas sp.(1)
NCPPB 4173	-	PD 2318	Aureobacterium sp. (2)
NCPPB 4174	81	IVIA 1844.06	Flavobacterium sp. (1)(2)
(1) Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem. (2) Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití specifických primerů OLI-1 a Y-2 (viz dodatek 6). (3) Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám pouze u banánů v Indonésii.

Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů
Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že pocházejí z původních sbírek kultur.

Kód NCPPB	SMT #	Jiné kódy	Země původu	Biovar
NCPPB 4153	6	CFBP 4582, Pr 3020, EURS11	Egypt	2
NCPPB 4154	10	CFBP 4585, 550, EURS21	Turecko	2
NCPPB 3857	12	CFBP 4587, Pr 1140, EURS26	Anglie	2
NCPPB 1584	23	CFBP 4598, EURS49	Kypr	2
NCPPB 2505	24	CFBP 4599, EURS50	Švédsko	2
NCPPB 4155	26	CFBP 4601, 502, EURS55	Belgie	2
NCPPB 4156 (*)	71(*)	PD 2762, CFBP 3857	Nizozemsko	2
NCPPB 4157	66	LNPV 15.59	Francie	2
NCPPB 4158	39	CFBP 4608, Port 448, EURS80	Portugalsko	2
NCPPB 4160	69	IVIA-1632-2	Španělsko	2
NCPPB 4161	76	B3B	Německo	2
NCPPB 325	41	CFBP 2047, KEL60-1, R842	USA	1
NCPPB 3967	42	CFBP 4610, R285, GONg7	Kostarika	1
NCPPB 4028	43	CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205	Kolumbie	2
NCPPB 3985	44	CFBP 4612, R578, CIP312	Peru	2T
NCPPB 3989	45	CFBP 4613, R568, CIP226	Brazílie	2T
NCPPB 3996	46	CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225	Peru	3
NCPPB 3997	47	CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131	Austrálie	3
NCPPB 4029	48	CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861	Srí Lanka	4
NCPPB 4005	49	CFBP 4616, R470	Filipíny	4
NCPPB 4011	50	CFBP 4617, R288, HEmps2	Čína	5
(*) Jako standardní referenční kmen se použije R. solanacearum biovar 2 (rod 3).

Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru k negativní kontrole všech testů.
Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující 10³ až 10⁴ a 10⁴ až 10⁶ buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů. Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity.
b) Komerční standardizovaný kontrolní materiál
Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky kultur NCPPB.
Ve formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 10⁶ buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole sérologických testů.

Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.
Užitečné mohou být následující složky:

	Účel	Množství (na litr)
Lubrolové vločky	Protisrážlivý prostředek (*)	0,5 g
DC silikonový odpěňovač	Odpěňovací činidlo (*)	1,0 ml
Tetrasodiumpyrofosfát	Antioxidační činidlo	1,0 g
Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP – 40)	Vázání inhibitorů PCR	50 g
(*) pro použití při extrakci homogenizací

Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.

Na2 HPO4 (bezvodý)	4,26 g
KH2PO4	2,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

1.1 Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)

Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.
1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)

Na2HPO4.12H2O	2,7 g
NaH2PO4. 2H2O	0,4 g
Destilovaná voda	1,00 l

Na2CO3	6,36 g
NaH CO3	11,72 g
Destilovaná voda	1,00 l

3.1. Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.
Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a steriluje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.

Dodatek 3

Pufry pro testovací postupy
Dodatek 4
OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.

Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 10³ až 10⁴ buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií (viz dodatek 3).
Poznámka:
Validované protokoly a činidla pro PCR
Dodatek 6

Dodatek 7
Validovaná činidla pro FISH test

Dodatek 8

3.2. Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10 x PBS), pH 7,4

NaCl	80,0 g
KH2PO4	2,0 g
Na2HPO4 . 12H2O	29,0 g
KCl	2,0 g
Destilovaná voda	1,00 l

10 x PBS	100 ml
10 % Tween 20	5 ml
Destilovaná voda	895 ml

3.3. PBS-Tween

3.4. Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).

10 x PBS	10,0 ml
Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44)	2,0 g
10 % Tween 20	0,5 ml
Sušené mléko	0,5 g
Destilovaná voda	doplnit do 100 ml

Rozpustí se a koncentrovanou HCl se upraví pH na 9,8.
Přidá se 0,2 g MgCl₂.

Diethanolamin	97 ml
Destilovaná voda	800 ml

Rozpustí se dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml roztoku.
Doplní se do 1 l destilovanou vodou.
3.5. Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8

Rozpustí se složky a zkontroluje pH 9,6.
4.1. Potahovací pufr, pH 9,6.

Na2CO3	1,59 g
NaH CO3	2,93 g
Destilovaná voda	1 000 ml

4.2. 10 x fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2‒ 7,4

NaCl	80,0 g
Na2HPO4.12H2O	27 g
NaH2PO4 . 2H2O	4g
Destilovaná voda	1 000 ml

10 x PBS	50 ml
10 % Tween 20	5 ml
Destilovaná voda	950 ml

4.3. PBS-Tween

Smíchá se a nastaví se hodnota pH 9,8 koncentrovanou HCl.

Diethanolamin	100 ml
Destilovaná voda	900 ml

4.4 Substrátový pufr, pH 9,8

Přímý primer OLI-1: 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp
1.1. Oligonukleotidové primery
Reverzní primer Y-2: 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	17,65 µl
10× pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1x (1,5mM MgCl2)
Směs dNTP (20mM)	0,25 µl	0,2 mM
Primer OLI-1 (20 µM)	1,25 µl	1µM
Primer Y-2 (20 µM)	1,25 µl	1µM
Taq polymerasa (5U/µl) (1)	0,1 µl	0,5 U
Množství vzorku	2,0 µl
Celkové množství	25 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

1.2. Reakční směs PCR

Poznámka:
1.3. Reakční podmínky PCR
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus:	i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)
	iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
	iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)
	vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.
Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.
Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g -3'
Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3
2.1. Oligonukleotidové primery

2.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	16,025 µl
10x pufr PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Ps-1 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Primer Ps-2 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Taq polymerasa (5U/µl) (1)	0,1 µl	0,5 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. Poznámka: Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích.

2.3 Reakční podmínky PCR
Poznámka:
Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
	iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
	iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)
	vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu
Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp (sada primerů RS).
Reverzní primerNS-6-R: 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'
Reverzní primer RS-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Přímý primer RS-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp (sada primerů NS).
Přímý primer NS-5-F: 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
3.1. Oligonukleotidové primery

3.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	12,625 µl
10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer RS-1-F (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Primer RS-1-R (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Primer NS-S-F (10 µM)(2)	0,15 µl	0,06 µM
Primer NS-6-R (10 µM)(2)	0,15 µl	0,06 µM
Taq polymeráza (5U/µl)(1)	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. (2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)). Použití extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat nové provedení optimalizace koncentrací reagencií.