6.1.2. Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu

1. Připraví se roztěr bakteriálního slizu z infikovaného pletiva nebo ze 48 hodinové kultury na živné půdě YPGA nebo SPA (dodatek 2) na mikroskopické sklíčko.

2. Připraví se pozitivní kontrolní roztěr kmenu biovaru 2 R. solanacearum a případně negativní kontrolní roztěr o známém PHB negativním sp.

3. Roztěry se nechají uschnout a spodní povrch každého sklíčka se rychle protáhne nad plamenem, aby se roztěry fixovaly.

Test súdánskou černí:
Test nilskou modří:
4. Preparáty se obarví buď nilskou modří nebo súdánskou černí a provede se mikroskopické pozorování podle níže uvedeného popisu:

a) Obě sklíčka se zakápnou 1% vodným roztokem nilské modři a nechají se inkubovat 10 minut při teplotě 55°C.

a) Zakápnou se všechna sklíčka 0,3% roztokem súdánské černi B v 70% etanolu a inkubují se 10 minut při pokojové teplotě.

b) Odstraní se barvící roztok. Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.

b) Odstraní se barvící roztok a krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku a odsaje se přebytečná voda savým papírem.

c) Roztěr se zakápne 8% vodním roztokem kyseliny octové a nechá se inkubovat 1 minutu při pokojové teplotě.

c) Sklíčka se ponoří krátce do xylolu a vysají se savým papírem. Upozornění: Xylol je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.

d) Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.

d) Sklíčka se zakápnou 0,5% (w/v) vodným roztokem safraninu a nechají 10 vteřin inkubovat při pokojové teplotě. Upozornění: safranin je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.

e) Znovu se navlhčí kapkou vody a přiloží se krycí sklíčko.

e) Sklíčka se opláchnou jemně tekoucí vodou z kohoutku, odsaje se přebytečná voda savým papírem a přiloží se krycí sklíčko.

f) Zkoumá se obarvený roztěr epifluorescenčním mikroskopem při 450 nm pod olejovou nebo vodní imersí se zvětšením 600× až 1000× s použitím objektivu pro olejovou nebo vodní imersi.

f) Zkoumá se obarvený roztěr mikroskopem s procházejícím světlem pod olejovou imersí a při zvětšení 1 000×.

g) Pozoruje se, zda se objeví na PHB granulích jasně oranžová fluorescence. Také se pozoruje v procházejícím normálním světle, zda jsou granule intracelulární a zda je morfologie buněk typická pro R. solanacearum.

g) Hledá se modročerné zbarvení PHB granulí v buňkách R. solanacearum s růžově zbarvenými stěnami buněk.