4. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vodě

4.1 Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve vodě

Princip
4.2. Metody detekce a identifikace R. solanacearum ve vodě
Validované schéma detekce popsané v tomto oddíle je použitelné k detekci patogenu ve vzorcích povrchové vody a rovněž může být použito k testování vzorků odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody. Očekávaná citlivost detekce se však liší v závislosti na substrátu. Citlivost testu selektivní izolace je ovlivňována populacemi konkurenčních saprofytických bakterií, kterých je obecně mnohem více v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě než v povrchové vodě. Zatímco níže uvedené schéma předpokládá detekci asi 10³ buněk/litr povrchové vody, citlivost detekce v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě bude pravděpodobně podstatně nižší. Z tohoto důvodu se doporučuje testovat odpadní vodu po provedení nějakého čistícího postupu (např. sedimentace nebo filtrace), při nichž dojde ke snížení saprofytických bakteriálních populací. Omezení citlivosti testovacího schématu by mělo být bráno v úvahu při hodnocení spolehlivosti v případě získání negativních výsledků.Vzhledem k tomu, že se toto schéma používá úspěšně k mapování výskytu nebo nepřítomnosti patogenu v povrchové vodě, je třeba si uvědomit jeho omezení při použití k podobnému mapování v odpadní vodě ze zpracování brambor a v odpadní vodě.

(1) Viz. oddíl 4.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování.

(10) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

(2) Metody koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 4.2.1. Koncentrace zvětšuje populaci jak patogenu, tak konkurenčních saprofytických bakterií a doporučuje se jen tehdy, jestliže nebrání izolačnímu testu.

(3) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Metody obohacovacího testu PCR jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(6) Metody obohacovacího testu ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.8.

(7) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(8) Kultivace může selhat z důvodu konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření, že velká saprofytická populace ovlivní spolehlivost izolace, opakují se izolační testy po zředění vzorku sterilní vodou.

(9) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

- Vzorky vody se odebírají v blízkosti hostitelských rostlin, pokud jsou přítomny.
4.2.1. Příprava vzorků
Poznámka:
- Zjištění R. solanacearum v povrchové vodě je nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, kdy teplota vody překračuje 15°C.
- Opakované vzorkování v různé době během výše uvedených období na určených vzorkovacích místech zvýší spolehlivost zjištění snížením vlivů výkyvů povětrnostních podmínek.
- Vlivem silných dešťů a geografie vodního toku může dojít ke značnému zředění a tím i zastření výskytu patogenu.

Viz. postupový diagram a popis testů v příslušných dodatcích.
4.2.2. Testování

4.2.1.2. Vzorky se přepravují v chladu a temnu (4-10°C) a testují do 24 hodin.

Koncentrace se obvykle nedoporučuje u vzorků vody ze zpracování brambor nebo u vzorků odpadní vody, protože zvýšená populace konkurenčních saprofytických bakterií inhibuje detekci Ralstonia solanacearum.
4.2.1.3. Je-li potřeba, může být provedena koncentrace bakteriální frakce pomocí následujících metod:

4.2.1.1. Na vybraných vzorkovacích místech se odeberou vzorky vody do sterilních zkumavek nebo lahviček na jedno použití, pokud možno 30 cm pod hladinou a 2 m od břehu. Při vzorkování odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody se odeberou vzorky z místa výtoku odpadní vody. Doporučená velikost vzorku je 500 ml. Je-li upřednostňována menší velikost, doporučuje se odebrat vzorky nejméně 3krát pro každé vzorkovací místo, z nichž každý bude obsahovat 2 opakované dílčí vzorky o velikosti nejméně 30 ml. Při intenzivním mapování se vyberou nejméně 3 vzorkovací místa na každé 3 km vodního toku a vzorkují se rovněž přítoky.

a) Odstřeďují se 30-50 ml dílčí vzorky při 10 000 g po dobu 10 minut (nebo 7000 g po dobu 15 minut), pokud možno při teplotě 4-10°C, slije se kapalina nad usazeninou a resuspenduje se peleta v 1 ml pufru (dodatek 4).

b) Provede se filtrace přes membránu (minimální velikost pórů 0,45 µm) s následným promytím filtru v 5-10 ml peletového pufru a zachycením filtrátu. Tato metoda je vhodná pro velké objemy vody, které obsahují malý počet saprofytů.