5. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby v půdě

5.1. Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum v půdě

(1) Viz. oddíl 5.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování

(2) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.

(3) Obohacovací PCR testy jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.

(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.

(5) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.

(6) Kultivace může selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření na vliv saprofytické populace na spolehlivost izolace, opakují se testy selektivní izolace po dalším zředění vzorku.

(7) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.

(8) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.

5.2. Metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum v půdě
Principy
Platné detekční schéma popsané v tomto oddíle je použitelné pro detekci patogenu ve vzorcích půdy, ale může být rovněž použito k testování vzorků pevného odpadu při zpracování brambor nebo kalu z odpadní vody. Je však nutné poznamenat, že tyto metody nejsou dostatečně citlivé, aby zaručovaly detekci nízkých nebo nepravidelně rozptýlených populací Ralstonia solanacearum, které se mohou vyskytovat v přirozeně infikovaných vzorcích těchto substrátů.
Při hodnocení spolehlivosti všech získaných negativních výsledků a také při sestavování přehledů určujících přítomnost patogenu v půdě nebo kalu je třeba vzít v úvahu omezenou citlivost tohoto testovacího schématu. Nejspolehlivějším testem přítomnosti patogenu v polní půdě je vypěstování náchylné hostitelské rostliny a její sledování, zda není infikována, ale i při použití této metody unikne nízký stupeň zamoření pozornosti.
Postupový diagram a popis testů jsou v příslušném dodatku.

5.2.1. Příprava vzorků

5.2.1.1. Vzorkování polní půdy by se mělo řídit standardními principy používanými pro vzorkování hlístů. Na jeden vzorek se shromáždí 0,5 až 1 kg půdy ze 60 míst na ploše 0,3 ha z hloubky 10-20 cm. Je-li podezření na výskyt patogenu, zvyší se počet sběrných míst na 120 z plochy 0,3 ha. Před testováním se uchovávají vzorky při teplotě 12-15°C. Kal ze zpracování brambor a kanalizace se navzorkuje shromážděním celkem 1 kg z míst reprezentujících celkový objem testovaného kalu. Před testováním se každý vzorek dobře promíchá.

5.2.1.2. Dílčí vzorky 10-25 g půdy nebo kalu se rozptýlí rotační třepačkou (250 ot./min) v 60-150 ml extrakčního pufru (dodatek 4) po dobu 2 hodin. Je-li třeba, přidání 0,02% sterilního Tween-20 a 10-20 g sterilních kamínků může napomoci disperzi.

5.2.1.3. Během testování se udržuje suspenze v teplotě 4°C.

5.2.2. Testování