6.1.4.1. Očkování na živnou půdu
Poznámka:
Než se použije tato metoda poprvé, provede se předběžný test k zajištění reprodukovatelné detekce 10³ až 10⁴ jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaných do extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Použije se řádně validovaná selektivní živná půda, např. SMSA (ve znění Elphinstone et al., 1996; viz. dodatek 2).
Rozlišení R. solanacearum od jiných bakterií schopných na živné půdě růst vyžaduje velkou pozornost. Dále, kolonie R. solanacearum mohou mít atypickou morfologii, jestliže Petriho misky jsou přeplněny nebo jsou rovněž přítomny antagonistické bakterie. Je-li podezření na konkurenci nebo inhibici, měl by být vzorek otestován znovu pomocí jiného testu.
Při použití čerstvě připravených extraktů ze vzorků lez očekávat, že citlivost detekce touto metodou bude velmi vysoká. Metoda je však použitelná i pro extrakty, které byly uchovány v glycerolu při teplotě od -68 do -86°C.
Pozitivní kontroly se připraví jako desetinné ředění ze suspenze 10⁶ cfu/ml virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762= CFBP 3857). K vyloučení možné kontaminace se připraví pozitivní kontrolní vzorky zcela odděleně od vzorků k testování.
U každé nově připravené šarže selektivní živné půdy by měla být před jejím použitím k rutinnímu testování vzorků nejdříve otestována její vhodnost pro kultivaci patogenu. Kontrolní materiál se testuje týmž způsobem jako vzorek (vzorky).
Poznámka:
Někdy se na tomto médiu tvoří atypické kolonie R. solanacearum. Mohou být malé, kruhové, zcela červené a nefluidní nebo jen částečně fluidní, a proto obtížně rozeznatelné od saprofytických bakterií tvořících kolonie.
Interpretace výsledků testu očkováním na selektivní média.
Test očkování na selektivní média je negativní, jestliže po 6 dnech nejsou zpozorovány žádné bakterie nebo nejsou nalezeny žádné podezřelé kolonie typické pro R. solanacearum, za předpokladu, že nedošlo k inhibici jinými bakteriemi a v kontrolních vzorcích jsou nalezeny typické kolonie R. solanacearum.
Test očkování na selektivní média je pozitivní, jestliže jsou izolovány podezřelé kolonie R. solanacearum.

1. Provede se ředění s cílem zajistit, aby všechny populace saprofytických bakterií byly vyloučeny. Nanese se 50-100 µl extraktu vzorku na 1 misku pro každé ředění.

2. Misky se nechají inkubovat při teplotě 28°C. Po 48 hodinách se zkontroluje jejich stav a pak se provádí kontrola denně po 6 dní. Typické kolonie R. solanacearum na živné půdě SMSA jsou mléčně bílé, ploché, nepravidelné a fluidní a po 3 dnech inkubace se rozvine růžově až krvavě červené zbarvení ve středu s vnitřními pruhy nebo spirálami.

3. Předpokládané kolonie R. solanacearum se rozetřou nebo očkují metodou zřeďování na universální živnou půdu, aby se získaly izolované kolonie (viz. dodatek 2).

4. Kultury se uchovávají krátkodobě ve sterilní vodě (pH 6-8, bez chlóru) při pokojové teplotě v temnu nebo dlouhodobě ve vhodném ochranném médiu při teplotě -68 až -86°C nebo lyofilizované.

5. Provede se identifikace podezřelých kultur (viz. oddíl 6.2.) a test patogenity (viz oddíl 6.3).