B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH
Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná hustota přibližně 2 × 10⁸ buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.
Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum.
Zpracují se pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.
Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 µl resuspendované pelety.
Přenese se 100 µl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a protřepe se..
Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.
Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.
Připraví se alikvotní části z 100 µl ve sterilních zkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se při teplotě - 16 až - 24 °C až do doby použití.
Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejprve potvrzeny testem IF.
Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v 10⁶ a 10⁴ buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.