1.5 Příprava
1.5.1.1 Buňky
Dá se použít celá řada buněčných typů, včetně subklonů buněk L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 a TK6. U buněčných typů používaných v tomto testu musí být prokázaná citlivost vůči chemickým mutagenům, vysoká klonovací účinnost (cloning efficiency) a stabilní frekvence spontánních mutací. U buněk se kontroluje, zda nejsou kontaminovány mykoplazmaty; infikované buňky se použít nesmějí.
Test je třeba naplánovat tak, aby měl zvolenou citlivost a efektivnost (power). Počet buněk, počet kultur a koncentrace testované látky musí těmto definovaným parametrům vyhovovat.5) Minimální počet vitálních buněk, které přežijí expozici a použijí se v jednotlivých stadiích testu, je dán frekvencí spontánních mutací. Obecným vodítkem je, že počet buněk má být minimálně desetinásobkem převrácené hodnoty frekvence spontánních mutací. Doporučuje se však použít alespoň 106 buněk. Měly by být k dispozici adekvátní historické údaje, kterými by se prokázala bezproblémové zvládnutí testu.
1.5.1.2 Média a kultivační podmínky
Je třeba použít vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentraci CO2, teplotu a vlhkost). Média se pro test volí podle selekčního systému a typu buňky. Zvláště důležité je, aby podmínky kultivace zajišťovaly optimální růst buněk během expresní periody a schopnost jak mutovaných, tak nemutovaných buněk tvořit kolonie.
1.5.2 Podmínky testu
1.5.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum
U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9.
Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.
1.5.2.2 Koncentrace
Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.
Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu buněk, jako je relativní klonovací účinnost (přežití) nebo relativní celkový růst. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.
Použijí se minimálně čtyři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. Vychází-li maximální koncentrace z cytotoxicity, měla by vést k relativnímu přežití (relativní klonovací účinnosti) nebo relativnímu celkovému růstu v 10–20 %, ne však méně než 10 %. U relativně netoxických látek by maximální expoziční dávka měla být nejnižší z hodnot 5 mg/ml, 5 μl/ml a 0,01 M.
U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. Může být účelné vyhodnotit rozpustnost na začátku a na konci působení, jelikož se rozpustnost může během expozice v důsledku přítomnosti buněk, S9, séra atd. měnit. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.
1.5.2.3 Kontroly
V rámci každého experimentu se musejí provést i souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo, vehikulum) kontroly, a to jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrola látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:
| Metabolická aktivace | Lokus | Látka | CAS | EINECS |
|---|---|---|---|---|
| Ne | HPRT | ethyl methansulfonát | 62-50-0 | 200-536-7 |
| ethyl nitrosomočovina | 759-73-9 | 212-072-2 | ||
| TK (malé a velké kolonie) | methyl methansulfonát | 66-27-3 | 200-625-0 | |
| XPRT | ethyl methansulfonát | 62-50-0 | 200-536-7 | |
| ethyl nitrosomočovina | 759-73-9 | 212-072-2 | ||
| Ano | HPRT | 3-methylcholantren | 56-49-5 | 200-276-4 |
| N-nitrosodimethylamin | 62-75-9 | 200-549-8 | ||
| 7,12-dimethylbenzantracen | 57-97-6 | 200-359-5 | ||
| TK (malé a velké kolonie) | Cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu | 50-18-0 6055-19-2 | 200-015-4 | |
| benzo[a]pyren | 50-32-8 | 200-028-5 | ||
| 3-methylcholantren | 56-49-5 | 200-276-5 | ||
| XPRT | N-nitrosodimethylamin (pro vysoké koncentrace S-9) | 62-75-9 | 200-549-8 | |
| benzo[a]pyren | 50-32-8 | 200-028-5 |
Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky; jestliže má například laboratoř historické údaje o 5-brom-2'-deoxyuridinu (CAS 59-14-3, číslo EINECS 200-415-9), lze použít i tuto referenční látku. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.
Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění, ledaže existují historické údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevykazuje žádné pro buňky nepříznivé či mutagenní účinky.
1.5.1.3 Příprava kultur
Buňky se namnoží ze zásobních kultur, inokulují do kultivačního média a inkubují při teplotě 37°C. Před provedením testu, je třeba kultury zbavit dříve vzniklých mutovaných buněk.
1.5.3 Postup
1.5.3.1 Expozice testovanou látkou
Na proliferující buňky se působí testovanou látkou jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Expozice probíhá po vhodnou dobu (obvykle je účinná doba 3–6 hodin). Doba expozice může přesáhnout jeden nebo více buněčných cyklů.
Pro každou koncentraci se používají kultury duplicitní nebo jenom jedna. Používá-li se jenom jedna kultura, je třeba zvýšit počet koncentrací tak, aby se zajistil adekvátní počet kultur k analýze (tj. minimálně osm analyzovatelných koncentrací). Kultury s negativní kontrolou (rozpouštědlem/vehikulem) se používají duplicitní.
V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob.5)
1.5.3.2 Hodnocení přežívání, viability a mutační frekvence
Po skončení expozice se buňky promyjí a kultivují ke stanovení přežívání a fenotypické exprese. Po expozici se obvykle začíná s analýzou cytotoxicity stanovením klonovací účinnosti - cloning efficiency nebo relativního celkového růstu.
Každý lokus má určitou minimální časový interval pro téměř optimální expresi nově indukovaných mutantů (HPRT a XPRT vyžaduje minimálně 6 – 8 dní, TK minimálně 2 dny). Buňky se pěstují v médiu s a bez selekčního činidla pro stanovení počtu mutantů a klonovací účinnosti. Po skončení doby exprese se začne s analýzou životnosti (používané k výpočtu četnosti mutantů) inokulací buněk na neselekční médium.
Pokud je látka v testu L5178Y TK+/- pozitivní, je třeba minimálně na jedné z experimentálních kultur (nejvyšší pozitivní koncentrace) a na negativních a pozitivních kontrolách stanovit velikost kolonií. Pokud je látka v tomto testu negativní, změří se velikost kolonií u negativní a pozitivní kontroly. Měření se může provést i ve studiích s TK6TK+/-.
1.5.1.4 Metabolická aktivace
Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254,5) nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu.5)
Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 – 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná chemikálie. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.
Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).
1.5.1.5 Příprava testované látky
Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.