1.5 Postup

1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
V každé zkušební a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných samců.

1.5.2 Dávkovací schéma
Testovaná látka se podává nejlépe jednorázově nebo ve dvou dávkách. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace rozdělit, tj. na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musí být vědecky odůvodněné.
V případě skupiny s nejvyšší dávkou se vzorky po expozici látce odebírají dvakrát. Jelikož testovaná látka může ovlivňovat kinetiku buněčného dělení, provádí se jeden dřívější a jeden pozdější odběr zhruba 24 a 48 hodin po expozici. U ostatních dávek (tj. mimo dávku nejvyšší) se odběr vzorků provádí po 24 hodinách nebo po 1,5-násobku délky buněčného cyklu po expozici, ledaže je znám vhodnější časový interval pro detekci účinku.⁵)
Kromě toho mohou být použity jiné časové intervaly odběru vzorků. Např. jedná-li se o látku zpomalující pohyb chromozómů během mitósy, nebo látku s účinky nezávislými na S-fázi cyklu, jsou vhodnější dřívější doba odběru vzorku.⁵)
Zda je vhodné nechat látku působit opakovaně, se posuzuje případ od případu. Pokud se provádí aplikace látky opakovaně, usmrcují se zvířata po 24 hodinách (1,5-násobku buněčného cyklu) od poslední aplikace. Odběry lze provádět i v dalších intervalech, považuje-li se to za účelné.
Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3–5 hodin, u čínských křečků zhruba 4–5 hodin.

1.5.3 Dávkování
Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii.⁵) Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější čas odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální.
Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity ve spermatogoniích (např. pokles poměru mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi; tento pokles nemá být vyšší než 50 %).

1.5.4 Limitní test
Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Podle očekávané humánní expozice se může použít v limitním testu vyšší dávky.

1.5.5 Aplikace látky
Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

1.5.6 Příprava chromozómů
Okamžitě po usmrcení zvířete se připraví z jednoho nebo z obou varlat buněčná suspenze, na kterou se působí hypotonickým roztokem a fixuje se. Buněčná suspenze se nakape na podložní sklo a obarví.

1.5.7 Analýza
U každého jedince se analyzuje minimálně 100 dobře rozprostřených metafází (tj. minimálně 500 metafází v jedné skupině). Tento počet se dá snížit, je-li počet pozorovaných aberací vysoký. Všechny mikroskopické preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven číslu 2n ± 2.