1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.7)
1.1 Úvod
Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze provést stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací po získaní prvních informací o toxicitě z testů akutní toxicity nebo toxicity při 28denní opakované aplikaci. Tato 90denní studie poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by mohlo nastat vlivem opakované expozice látce v průběhu delšího období, zahrnujícího vývoj po odstavení a růst až do dospělosti. Studie má poskytnout informace o významných toxických účincích, určit cílové orgány a možnou kumulaci a může poskytnout odhad hladiny bez pozorovaného nepříznivého účinku, kterou lze použít při výběru úrovni dávek pro chronické studie a pro stanovení bezpečnostních kritérií pro expozici člověka.
Tato metoda umožňuje zjistit nepříznivé účinky vyvolané chemickou látkou na nehlodavcích a používá se pouze tehdy, když:
- účinky pozorované v jiných studiích naznačují potřebu objasnit či charakterizovat je na dalším druhu než na hlodavcích nebo když
- toxikokinetické studie naznačují, že použití specifického druhu nehlodavce je nejvhodnější volbou laboratorního zvířete, nebo když
- jiné konkrétní důvody zdůvodňují použití nehlodavce.
Viz též Všeobecný úvod, Část B.
1.2 Definice
Dávka: je podané množství testované látky. Dávka se vyjadřuje buď jako hmotnost (v g, mg), nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti testovaného zvířete (např. mg/kg) nebo jako konstantní koncentrace v potravě (ppm) nebo v pitné vodě.
Dávkování: je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání.
NOAEL (no observed adverse effect level): je zkratka pro hladinu bez pozorovaného nepříznivého účinku a odpovídá nejvyšší dávce nebo expozici, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky související s podáváním látky.
1.3 Princip metody
Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během podávání se zvířata pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu nebo jsou utracena, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.
1.4 Popis metody
1.4.1 Výběr zvířecích druhů
Obvykle používaným druhem nehlodavce je pes; je třeba definovat plemeno - často se používá beagle. Lze použít i jiné druhy, např. prasata nebo miniprasata. Primáti se nedoporučují, použijí-li se, musí to být zdůvodněno. Používají se mladá, zdravá zvířata, v případě psů se má s podáváním začít ve věku 4-6 měsíců a ne starším než 9 měsíců. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a plemeno.
1.4.2 Příprava zvířat
Používají se zdravá zvířata, která dosud nebyla vystavena žádným experimentálním zásahům a která jsou před testem chována v experimentálních podmínkách. Doba aklimatizace závisí na vybraném druhu a na původu zvířat. Doporučuje se nejméně pět dní pro psy či prasata z vlastního chovu a nejméně 2 týdny pro zvířata z externích chovných zařízení. Musí se popsat druh, kmen, původ, pohlaví, hmotnost a/nebo věk. Zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní a do jednotlivých experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby se vlivy jejich umístění minimalizovaly. Každému zvířeti se přiřadí jedinečné identifikační číslo.
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)
1.4.3 Příprava dávek
Testovanou látku lze podávat v potravě nebo v pitné vodě, sondou nebo v kapslích. Způsob orálního podávání závisí na účelu studie a na fyzikálních a chemických vlastnostech testované látky.
Pokud je to nezbytné, testovaná látka se rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku, potom roztoku nebo emulze nebo suspenze v oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiném vehikulu. Pro nevodná vehikula je třeba znát jejich toxikologickou charakteristiku. Je třeba stanovit stabilitu testované látky v podmínkách aplikace.
1.5 Postup
1.5.1 Počet a pohlaví
Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 8 zvířat (4 samice a 4 samci). Počítá-li se s usmrcováním v průběhu studie, měl by být tento počet zvýšen o počet zvířat, která mají být v průběhu studie usmrcena. Počet zvířat na konci studie musí být dostatečný, aby bylo možno provést smysluplné vyhodnocení toxických účinků. Na základě dřívějších znalostí o testované chemické látce nebo jí blízce příbuzné látce je třeba zvážit i přidání další (satelitní) skupiny zvířat 8 (4 zvířat každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po ukončení aplikace mohlo posoudit, zda jsou případné účinky vratné nebo trvalé. Trvání tohoto následného pozorování se stanoví s ohledem na pozorované účinky.
1.5.1.1 Úrovně dávek
Neprovádí-li se limitní test (viz 1.5.3), použijí se nejméně 3 úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek mohou vycházet z výsledků studií při opakované aplikaci nebo orientačních studií zaměřených na zjištění rozsahu účinných dávek a měly by zohledňovat všechny existující toxikologické a toxikokinetické údaje o testované látce nebo o příbuzných látkách. Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha či biologické účinky testované látky, má nejvyšší hladina dávky vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo velké utrpení. Další hladiny dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly toxické účinky odstupňované podle dávky a aby u nejnižší hladiny nebyly pozorovány nepříznivé účinky (NOAEL). Často je pro odstupňování dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný poměr mezi dávkami; je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu, než mít intervaly mezi dávkami příliš široké (např. více než 6-10násobek).
Kontrolní skupině se nepodává žádná látka nebo, používá-li se vehikulum, je kontrolní skupině podáváno vehikulum. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Je-li použito vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Podává-li se testovaná látka v potravě a způsobuje-li omezení příjmu potravy, doporučuje se použít paralelní skupinu se stejným omezením potravy, aby se odlišil vliv snížení příjmu potravy nechutenstvím od toxikologických změn.
Má se přihlédnout i k následujícím vlastnostem vehikula a ostatních aditiv: vliv na vstřebávání, distribuci, metabolismus nebo retenci testované látky; vliv na chemické vlastnosti testované látky, které mohou změnit její toxicita; vliv na spotřebu potravy, vody nebo na nutriční stav zvířat.
1.5.1.2 Limitní test
Pokud test provedený níže popsanou metodou na dávkové úrovni 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti nebo vyšší neukáže pozorovatelné nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není nutné provést kompletní studii se třemi úrovněmi dávek. Tento limitní test se neprovádí, naznačují-li údaje o expozici lidí použití vyšších dávek.
1.5.2 Aplikace
Testovaná látka se zvířatům aplikuje 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Jiný režim aplikace, např. 5 dnů v týdnu, musí být zdůvodněn. Aplikuje-li se testovaná látka sondou nebo kanylou měla by být aplikace jen v jediné dávce. Maximální objem tekutiny, který lze podat najednou, závisí na tělesné hmotnosti zvířete. Zpravidla se udržuje co nejnižší objem. S výjimkou dráždivých nebo leptavých látek, jejichž účinky se zhoršují s koncentrací, je třeba rozdíly podávaných objemů minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl ve všech hladinách dávek podáván týž objem.
U látek podávaných potravou nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství podávané látky neovlivnilo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou nebo v kapslích, mělo by se podávat každý den ve stejnou dobu; je třeba dávkování upravovat tak, aby bylo konstantní vzhledem k změnám tělesné hmotnosti zvířete. Je-li 90denní studie předběžnou studií k dlouhodobé studii chronické toxicity, má být v obou studiích použita stejná dieta.
1.5.3 Pozorování
Doba pozorování je nejméně 90 dní. Zvířata v satelitní skupině určená k následnému pozorování se ponechají vhodnou dobu bez aplikace, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení nebo zda toxické účinky přetrvávají.
Běžné klinické pozorování je třeba provádět nejméně jednou denně, nejlépe vždy ve stejnou denní dobu, v době očekávaného maximálního účinku. Klinický stav zvířat se zaznamenává. Nejméně dvakrát denně, obvykle na začátku a na konci každého dne, se provede prohlídka u všech zvířat za účelem zjištění úmrtí a příznaků onemocnění.
Alespoň jednou před první aplikací látky a dále jednou týdně se provede důkladné klinické pozorování všech zvířat za účelem intraindividuálního srovnání. Pozorování je třeba provádět mimo chovnou klec, nejlépe ve standardním pozorovacím prostoru a pokaždé ve stejnou dobu. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily minimálně. Příznaky toxicity je třeba pečlivě zaznamenávat, včetně doby nástupu, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje přinejmenším změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů a změny autonomních funkcí (slzení, piloerekce, velikost zornic, poruchy dýchání). Zaznamenávají se změny chůze a držení těla, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a/nebo tonických pohybů, stereotypů (např. nadměrné čištění, opakované kroužení) nebo bizarní chování.
Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale nejméně u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolní skupiny. Zjistí-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
1.5.3.1 Tělesná hmotnost a spotřeba potravy/vody
Všechna zvířata se váží nejméně jednou týdně. Příjem potravy se zjišťuje nejméně jednou týdně. Provádí-li se aplikace v pitné vodě také nejméně jednou týdně se zaznamená spotřeba vody. Ke spotřebě vody je potřeba přihlédnout ve studiích, kdy se podává testovaná látka v potravě nebo sondou, během nichž může dojít ke změně příjmu tekutin.
1.5.3.2 Hematologie a klinická biochemie
Krev se odebírá z určeného místa a skladuje se za vhodných podmínek. Na konci testování se vzorky odebírají těsně před utracením nebo při něm.
Z odběrů krve na počátku testování a pak v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a poté i na konci se provádí následující hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počet erytrocytů, celkový a diferenciální počet leukocytů, počet destiček, test na srážlivost krve, stanoví se protrombinový a trombinový čas.
Biochemická analýza zaměřená na posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na ledviny a játra, se provede z krevních vzorků odebraných každému zvířeti na počátku studie a v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a na konci studie.
Je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus cukrů,funkce jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním mechanizmu účinku látky. Před odběrem krve se doporučuje nechat zvířata nalačno po dobu vhodnou pro daný druh. Doporučuje se stanovení vápníku, fosforu, chloridů sodíku, draslíku, glykémie nalačno, alaninaminotransferázy, aspartátaminotransferázy, ornitindekarboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku močoviny, albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkové bílkoviny v séru.
Minimálně na počátku, v polovině a na konci studie provést vyšetření moči z časově definovaného sběru. Hodnotí se následující parametry: vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukóza a krev/krvinky. V případě potřeby se mohou použít další analýzy pro studium širšího spektra účinků.
Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání. Mezi další testy, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu a aktivity cholinesterázy. Je-li zapotřebí na základě pozorovaných účinků rozšířit zkoumání, lze přidat i další klinicko-biochemické testy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.
Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované či očekávané účinky dané látky.
1.5.3.3 Pitva
U všech zvířat použitých ve studii se provede podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra s žlučníkem, ledviny, nadledviny, varlata, nadvarlata, vaječníky, děloha, štítná žláza (s příštítnými tělísky), brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě těch, která byla nalezena mrtvá nebo usmrcena průběžně) se pečlivě očistí od ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.
Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném fixačním médiu pro daný typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými lézemi, mozek (reprezentativní oblasti včetně předního mozku, mozečku a prodloužené míchy), mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, oči, štítná žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Pleyerových plátů), játra, žlučník, slinivka břišní, ledviny, nadledviny, slezina, srdce, průdušnice a plíce, aorta, pohlavní žlázy, děloha, přídatné pohlavní orgány, samičí mléčná žláza, prostata, močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (a/nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně) a kůže. Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zkoumat i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba konzervovat.
1.5.3.4 Histopatologická vyšetření
U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.
Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.
U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histopatologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.