1.4 POSTUP

1.4.1 Počet a pohlaví pokusných zvířat
Každá experimentální i kontrolní skupina by měla obsahovat dostatečný počet pokusných zvířat, aby bylo možné získat minimálně 20 březích samic s přibližně stejným termínem vrhu. To pravděpodobně nebude možné u látek, které vyvolávají nežádoucí účinky spojené s aplikací (např. sterilitu, nadměrnou toxicitu při vysoké dávce). Cílem je získat dostatečný počet březích samic, a tím zajistit významné hodnocení potenciálu dané látky ovlivnit plodnost, březost, chování samic a kojených mláďat, růst a vývoj potomstva generace F1 od doby početí až do doby dospělosti a vývoj jejich potomstva (F2) až do odstavení. Nepodaří-li se však dosáhnout požadovaného počtu březích pokusných zvířat (tj. 20), nemusí to nutně znamenat znehodnocení studie, a proto by hodnocení mělo vždy probíhat individuálně případ od případu.

1.4.2 Příprava dávek
Není-li jiný vhodnější způsob aplikace (např. kožní nebo inhalační), doporučuje se orální podávání zkoušené látky (v krmivu, pitné vodě nebo pomocí žaludeční sondy).
Zkoušená látka se v případě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporučuje se zvážit použití vodného roztoku/suspenze, poté použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiném vehikulu. U jiného typu vehikula, než je voda, je třeba znát jeho toxikologické charakteristiky. Stanoví se stálost zkoušené látky v daném vehikulu.

1.4.3 Dávkování
Použijí se alespoň tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Není-li dávka limitována fyzikálně-chemickou podstatou nebo biologickými účinky zkoušené látky, zvolí se nejvyšší úroveň dávky tak, aby vyvolala toxicitu, ale nezpůsobila úhyn nebo silné bolesti. V případě neočekávané mortality jsou obvykle ještě přijatelné studie s úmrtností rodičovských (P) pokusných zvířat nižší než přibližně 10 %. Ve snaze prokázat jakoukoli reakci související s dávkováním a s hodnotou dávky bez pozorovatelného nepříznivého účinku (NOAEL) se zvolí sestupná posloupnost úrovní dávek. Pro nastavení sestupných úrovní dávek jsou obvykle optimální intervaly lišící se faktorem 2 až 4 a často je vhodnější přidání čtvrté zkušební skupiny než používání velkých intervalů mezi jednotlivými dávkami (např. lišících se faktorem 10). U studií by dávky krmiva neměly být více než trojnásobné. Při výběru úrovně dávek je třeba vzít v úvahu jakékoliv existující údaje o toxicitě, a to zvláště v případě výsledků studií po opakované dávce. Rovněž je třeba vzít v úvahu jakékoliv existující informace o metabolismu a kinetice zkoušené sloučeniny nebo příbuzných látek. Tyto informace navíc napomohou rovněž při prokazování přiměřenosti dávkovacího režimu.
Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina s vehikulem, pokud se vehikulum pro aplikaci zkoušené látky používá. S výjimkou aplikace zkoušené látky je třeba s pokusnými zvířaty v kontrolní skupině zacházet naprosto stejným způsobem jako s pokusnými zvířaty v experimentální skupině. Používá-li se vehikulum, podá se kontrolní skupině v nejvyšším používaném objemu. Podává-li se zkoušená látka v krmivu a způsobuje-li snížený příjem nebo využití krmiva, pak je třeba zvážit nutnost použití párově krmené kontrolní skupiny. Jinak lze místo souběžné párově krmené kontrolní skupiny použít údaje získané z kontrolovaných studií určených k hodnocení účinků snížené spotřeby krmiva na reprodukční parametry.
Pozornost je třeba věnovat následujícím typickým znakům vehikula a jiných přísad: účinku na absorpci, distribuci, metabolismus, nebo retenci zkoušené látky, dále vlivu na chemické vlastnosti zkoušené látky, které mohou změnit její toxikologické vlastnosti, a vlivu na spotřebu krmiva, vody nebo nutriční stav pokusných zvířat.

1.4.4 Limitní zkouška
Pokud orální studie s jednou úrovní dávky v množství alespoň 1 000 mg /kg tělesné hmotnosti na den, nebo rovnocenné procento látky v krmivu nebo pitné vodě při aplikaci dávky v krmivu nebo pitné vodě pomocí postupů předepsaných pro tuto studii nevyvolá žádnou zjistitelnou toxicitu ani u rodičovských pokusných zvířat, ani u jejich potomstva a pokud se neočekává ani toxicita na základě existujících údajů o strukturně/metabolicky příbuzných sloučeninách, pak není nutné uvažovat o kompletní studii využívající několika úrovní dávek. Limitní zkouška se použije, pokud expozice u člověka nevyžaduje použít vyšší úroveň orální dávky. U dalších způsobů podávání látky, jako je inhalační nebo kožní aplikace, může být maximální dosažitelná úroveň expozice dána fyzikálně-chemickými vlastnostmi zkoušené látky.

1.4.5 Aplikace dávek
Zkoušená látka se podává pokusným zvířatům 7 dnů v týdnu. Upřednostňuje se orální způsob podávání (v krmivu, pitné vodě nebo žaludeční sondou). Pokud se používá jiný způsob podávání, je třeba podat zdůvodnění a provést odpovídající modifikace. Všem pokusným zvířatům by měla být látka během odpovídajícího experimentálního období podávána stejným způsobem. Objem jednorázově podávané tekutiny by neměl překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti (0,4 ml/100 g tělesné hmotnosti je maximum pro kukuřičný olej), výjimkou jsou vodné roztoky, kde lze použít 2 ml/100 g tělesné hmotnosti.
S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, u kterých vyšší koncentrace obvykle vedou ke zhoršení účinků, by měla být variabilita objemu podávané dávky minimalizována úpravou koncentrací tak, aby bylo zajištěno, že podávaný objem bude stejný pro všechny dávky.
Ve studiích zaměřených na podávání látky žaludeční sondou budou mláďata dostávat zkoušenou látku obvykle nepřímo prostřednictvím mléka, dokud nezačne přímé dávkování po jejich odstavení. Ve studiích zaměřených na podávání látky v krmivu nebo pitné vodě budou mláďata navíc dostávat zkoušenou látku přímo, jakmile začnou během posledního týdne laktačního období sama žrát.
U látky podávané krmivem nebo pitnou vodou je velmi důležité zajistit, aby množství použité zkoušené látky neovlivňovalo normální rovnováhu živin nebo vody, nebránilo vyváženosti běžného krmiva nebo vody. Je-li zkoušená látka podávána v krmivu, je třeba používat buď konstantní koncentrace (ppm) v krmivu, nebo konstantní úrovně dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti pokusného zvířete. Použití jiného způsobu je třeba zdůvodnit. Látka podávaná žaludeční sondou se podává každý den přibližně ve stejnou dobu a alespoň jednou týdně se přizpůsobí tak, aby se udržela konstantní úroveň dávky vzhledem k tělesné hmotnosti pokusného zvířete. Při přizpůsobování dávky podle hmotnosti u podávání látky sondou je třeba vzít v úvahu informace týkající se placentární distribuce.

1.4.6 Uspořádání pokusů
S každodenním podáváním zkoušené látky se u rodičovské generace (P) samců a samic zahájí od 5. do 9. týdne věku. Denní podávání látky u samců a samic generace F1 je třeba zahájit po jejich odstavení; stále je třeba mít na paměti, že v případě, kdy se zkoušená látka podává prostřednictvím krmiva nebo pitné vody, může docházet k přímé expozici mláďat F1 zkoušené látce již během laktačního období. U obou pohlaví (P i F1) by se mělo s podáváním látky pokračovat alespoň 10 týdnů před obdobím páření. S dávkováním se u obou pohlaví pokračuje i během dvoutýdenního období páření. Nejsou-li samci již nezbytní k hodnocení reprodukčních účinků, měli by být humánním způsobem usmrceni a vyšetřeni. U rodičovské generace (P) samic dávkování pokračuje i během březosti a až do odstavení potomstva generace F1. Pozornost je nutno věnovat modifikacím dávkovacího programu na základě dostupných informací o zkoušené látce, včetně existujících údajů o toxicitě, indukci metabolismu nebo bioakumulaci. Obvykle by dávka pro jednotlivá pokusná zvířata měla vycházet z aktuální zjištěné tělesné hmotnosti. Velkou pozornost je však třeba věnovat úpravě dávek během posledního trimestru březosti.
Podávání látky samcům a samicím generací P a F1 pokračuje až do doby jejich utracení. Všichni dospělí samci a samice generace P a F1 se humánním způsobem utratí, pokud již nejsou nezbytní k hodnocení reprodukčních účinků. Potomstvo generace F1, které není vybráno k páření, a celé potomstvo generace F2 se po odstavení humánním způsobem utratí.

1.4.7 Páření

1.4.7.1 Připouštění rodičovské generace (P)
U každého páření se každá samice umístí s jedním samcem se stejnou úrovní dávek (párování 1:1), dokud nedojde ke spáření, nebo po dobu alespoň 2 týdnů. Každý den se samice vyšetří na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Nultým dnem březosti je den, kdy je pozorována vaginální zátka nebo spermie. V případě, že je spáření neúspěšné, se zváží spáření se samci s osvědčenou plodností ze stejné skupiny. Spářené páry se v záznamech jasně označí. Je třeba se vyvarovat páření sourozenců.

1.4.7.2 Páření generace F1
U páření pokusných zvířat generace F1 se za účelem produkce generace F2 po odstavení vybere z každého vrhu alespoň jeden samec a samice pro spáření s jinými pokusnými zvířaty ze stejné dávkové skupiny, ale z odlišného vrhu. Výběr pokusných zvířat z každého vrhu se provede náhodně, pokud nejsou mezi pokusnými zvířaty z daného vrhu pozorovány žádné výrazné odlišnosti v tělesné hmotnosti nebo vzhledu. V případě zjištěných odlišností se z každého vrhu vyberou nejkvalitnější jedinci. Logicky by bylo nejlepší tento výběr provádět na základě tělesné hmotnosti, ale vhodnější se může jevit výběr na základě vzhledu. Potomstvo generace F1 by se nemělo připouštět před dosažením plné pohlavní zralosti.
Páry, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit za účelem zjištění příčiny neplodnosti. Tento postup může zahrnovat umožnění další příležitosti k oplodnění s pokusným zvířetem s osvědčenou plodností, mikroskopické vyšetření reprodukčních orgánů anebo vyšetření estrálního cyklu a spermatogeneze.

1.4.7.3 Druhé páření
V určitých případech, jako např. u odchylek velikosti vrhu spojených s aplikací nebo při zjištění nejednoznačného účinku po prvním páření, se doporučuje opětovné připuštění dospělých pokusných zvířat z generace P a F1 za účelem produkce druhého vrhu. Rovněž se doporučuje znovu připustit samice nebo samce, u kterých nedošlo k produkci mláďat s osvědčenými pokusnými zvířaty. Pokud je u jakékoliv generace nezbytná produkce druhého vrhu, měla by být pokusná zvířata opakovaně připuštěna přibližně jeden týden po odstavení posledního vrhu.

1.4.7.4 Velikost vrhu
Pokusným zvířatům se ponechá možnost normálně vrhnout a pečovat o svoje potomstvo až do jeho odstavení. Standardizace velikosti vrhů je dobrovolná. Pokud se standardizace provádí, je nutné používanou metodu detailně popsat.