1.8 Popis metody

1.8.2 Příprava

1.8.2.1 Buňky
Při validační studii byla použita stabilizovaná buněčná linie myších fibroblastů Balb/c 3T3 klon 31, a to buď z ATCC nebo z ECACC; ta se proto doporučuje. Podle stejného protokolu se dají s úspěchem použít i jiné buňky nebo buněčné linie, pokud se kultivační podmínky upraví podle jejich specifických potřeb; je však třeba prokázat, že jsou stejně vhodné.
U buněk je třeba pravidelně kontrolovat, že nejsou kontaminovány mykoplazmaty, a smí se použít jen v případě, že je výsledek kontroly uspokojivý.
Jelikož citlivost buněk vůči UVA záření může s počtem pasáží narůstat, je třeba používat buňky Balb/c 3T3 z pasáže s nejnižším číslem, pokud možno nižším než 100. Citlivost buněk Balb/c 3T3 vůči UVA záření je třeba pravidelně kontrolovat, a to postupem kontroly jakosti popsaným v tomto metodickém návodu.

1.8.2.2 Média a kultivační podmínky
Pro rutinní pasážování buněk a během postupu je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky. V případě buněk Balb/c 3T3 se jedná o DMEM (Dulbeccova modifikace Eagleova media) obohacený 10 % séra novorozených telat, 4 mM glutaminu, penicilinem a streptomycinem a o inkubaci ve vlhkém prostředí při teplotě 37°C / 7,5 % CO₂. Je nezbytné, aby podmínky kultivace zajišťovaly buněčný cyklus v normálním historickém rozmezí pro dané buňky resp. buněčnou linii.

1.8.2.3 Příprava kultur
Buňky ze zmražených zásobních kultur se nasadí v příslušné hustotě v kultivačním médiu a minimálně jednou se před použitím v testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro pasážují.
Pro test fototoxicity se buňky nasadí v kultivačním médiu v takové hustotě, aby na konci testu (tj. kdy se stanovuje životaschopnost buněk 48 hodin po nasazení) nedošlo ke konfluenci (ke splynutí v souvislou, jednolitou vrstvu buněk). V případě buněk Balb/c 3T3 kultivovaných v destičkách s 96 jamkami se doporučuje hustota 1 x 10⁴ buněk v jedné jamce.
Pro každou testovanou látku se buňky nasazují identicky na dvě destičky s 96 jamkami, které pak procházejí celým postupem za identických kultivačních podmínek, s výjimkou doby, kdy je jedna z destiček ozařována (+UVA/VIS) a druhá je uchovávána v temnu (–UVA/VIS).

1.8.2.4 Metabolická aktivace
Zatímco při všech testech in vitro pro posouzení genotoxického nebo karcinogenního potenciálu je obecným požadavkem použití metabolizujícího systému, není v případě fototoxikologie známa žádná látka, kde by k tomu, aby působila jako fototoxin in vivo nebo in vitro, bylo metabolické transformace zapotřebí. Nepokládá se proto ani za nutné, ani za vědecky odůvodněné, aby se tento test prováděl s nějakým metabolickým aktivačním systémem.

1.8.2.5 Testovaná látka / příprava
Testovaná látka musí být před použitím čerstvě připravena, ledaže údaje o její stabilitě prokazují, že se dá skladovat. Pokud je pravděpodobné, že by došlo k fotodegradaci, musí se příprava provádět pod červeným světlem.
Látka se rozpustí v pufrovaném solném roztoku, například v Earlově vyváženém solném roztoku (EBSS) nebo ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (phosphate buffered saline, PBS), který – aby nemohlo dojít k interferenci během ozařování – nesmí obsahovat žádné proteinové složky ani barevné indikátory pH, pohlcující světlo.
Pokud je testovaná látka ve vodě omezeně rozpustná, rozpustí se ve vhodném rozpouštědle v koncentraci stonásobně vyšší, než je požadovaná konečná koncentrace, a následně se zředí v poměru 1 : 100 pufrovaným solným roztokem. Pokud se používá rozpouštědlo, musí být přítomno v konstantním objemu 1 % (v/v) ve všech kulturách, tj. ve všech koncentracích testované látky i v negativních kontrolách.
Jako rozpouštědlo se doporučuje dimethylsulfoxid (DMSO) nebo ethanol (EtOH). Vhodná mohou být i další rozpouštědla s nízkou cytotoxicitou, například aceton, je však třeba vždy pečlivě zvážit jejich specifické vlastnosti, jako je případná reakce s testovanou látkou, potlačení fototoxického efektu nebo vychytávání radikálů.
Aby se napomohlo rozpouštění, dá se použít míchání resp. sonifikace, popřípadě ohřev na 37°C.

1.8.2.6 Ozařování UV světlem / příprava
Světelný zdroj: volba správného světelného zdroje a správná filtrace je při testování fototoxicity klíčovým faktorem. Záření v UVA a ve viditelné oblasti je obvykle spojováno s fotosenzibilizací,⁶) kdežto záření UVB je v tomto směru méně relevantní, je přímo vysoce cytotoxické, přičemž jeho cytotoxicita se při přechodu od 313 nm k 280 nm zvyšuje tisícinásobně.⁶) Mezi kritéria pro volbu světelného zdroje patří zásadní požadavek, aby emitoval vlnové délky, jež testovaná látka absorbuje, a aby byla světelná dávka (dosažitelná za přiměřenou dobu) postačující ke zjištění známých fotosenzibilizujících látek. Dále nesmějí být použité vlnové délky a dávky nepatřičně poškozující testovací systém – patří sem i vyzařování tepla (infračervená oblast).
Za optimální světelný zdroj se pokládají solární simulátory, jimiž se simuluje sluneční záření. Jako tyto simulátory se používají xenonové výbojky a dále (vysokotlaké) rtuťové halogenové výbojky – ty mají tu výhodu, že vyzařují méně tepla a jsou levnější, sluneční světlo však imitují hůře. Jelikož všechny solární simulátory emitují významné množství záření UVB, je třeba záření filtrovat tak, aby se toto vysoce cytotoxické záření dostatečně zeslabilo.
Pro test na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro je třeba použít spektrum záření, kde se složka UVB prakticky nevyskytuje (UVA:UVB ~ 20 : 1). Příklad spektrálního rozložení filtrovaného záření solárního simulátoru použitého při validační studii testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro byl publikován.⁶)
Dozimetrie: intenzita světla (iradiance) se musí pravidelně před každým testem fototoxicity kontrolovat pomocí vhodného širokopásmového UV-metru, který musí být kalibrován pro daný zdroj. Funkčnost UV-metru je třeba kontrolovat, k čemuž se doporučuje použít druhý, referenční UV-metr téhož typu a kalibrace. Ideální je, když se v delších intervalech měří spektrální iradiance filtrovaného světelného zdroje a kontroluje se kalibrace širokopásmového UV-metru pomocí spektroradiometru; taková instrumentace ovšem vyžaduje kvalifikovanou obsluhu vyškoleného personálu.
Při validační studii bylo zjištěno, že dávka UVA záření 5 J/cm² je pro buňky Balb/c 3T3 necytotoxická a přitom dostatečně silná, aby excitovala i slabě fototoxické látky. Aby se této dávky dosáhlo během 50 minut, musí být iradiance nastavena na 1,666 mW/cm². Použije-li se jiná buněčná linie nebo jiný zdroj světla, musí se dávka záření UVA upravit tak, aby buňky nepoškozovala a byla dostatečná k průkazu standardních fototoxinů. Doba světelné expozice se vypočítává podle vzorce:
$t\left(min\right)=\frac{dávkasvěte\ln éhozáření(J/c{m}^2\times 1000)}{intenzitaozáření(mW/c{m}^2\times 60)}(1J=1W.s)$

1.8.3 Podmínky testu
Maximální koncentrace testované látky nemá převýšit hodnotu 100 μg/ml, neboť všechny fototoxické látky byly detekovány při koncentracích nižších, při vyšších koncentracích se zvyšuje četnost falešně pozitivních výsledků.⁶) Hodnota pH při nejvyšší koncentraci testované látky musí být přijatelná (oblast pH 6,5 – 7,8).
Rozsah koncentrací testované látky při použití světla (+UVA) a bez něj (-UVA) je třeba stanovit v rámci předběžných experimentů. Rozsah a postup koncentrační řady se zvolí tak, aby křivky závislosti koncentrace-odezva byly dostatečně podloženy experimentálními údaji. Používá se koncentrační geometrická řada (s konstantním faktorem ředění).

1.8.4 Popis postupu

1.8.4.1 První den
Připraví se suspenze 1 x 10⁵ buněk/ml v kultivačním médiu. Do periferních jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky pro tkáňové kultury se odpipetuje po 100 μl samotného média (= slepý pokus), do ostatních jamek se dávkuje po 100 μl buněčné suspenze o denzitě 1 x 10⁵ buněk/ml (=1 x 10⁴ buněk na jamku). Pro každou testovanou látku se připraví dvě destičky – jedna pro stanovení cytotoxicity (-UVA), druhá pro stanovení fotocytotoxicity (+UVA).
Buňky se inkubují po dobu 24 hodin (7,5 % CO₂, 37 °C), aby se vytvořil semikonfluentní monolayer. Tato inkubační doba umožňuje regeneraci a adherenci buněk a jejich exponenciální růst.

1.8.4.2 Druhý den
Po inkubaci se kultivační médium z buněk odstraní a promyje dvakrát objemem 150 μl EBSS/PBS na každou jamku. Přidá se 100 μl EBSS/PBS obsahujícího testovanou látku v příslušné koncentraci nebo jenom rozpouštědlo (negativní kontrola). Testovaná látka se přidává v 8 koncentracích. Buňky s testovanou látkou se inkubují v temnu po dobu 60 minut (7,5 % CO₂, 37 °C).
Část testu s UVA (+UVA) se provádí tak, že se buňky za pokojové teploty ozařují po dobu 50 minut skrz víčko destičky s 96 jamkami zářením UVA o intenzitě 1,7 mW/cm² (= dávka 5 J/cm²). Aby nedocházelo ke kondenzaci vody pod víčkem, je třeba použít ventilátoru. Duplicitní destičky (-UVA) se po dobu 50 minut (= expoziční doba UVA) uchovávají za pokojové teploty v temném boxu.
Roztok se odstraní a jamky se promyjí dvakrát 150 μl EBSS/PBS. Poté se naplní kultivačním médiem a přes noc (18 - 22 hodin) se inkubují (7,5 % CO₂, 37 °C).

1.8.4.3 Třetí den
Mikroskopické hodnocení
Buňky se prohlédnou pod mikroskopem s fázovým kontrastem. Zaznamenají se změny morfologie buněk způsobené cytotoxickým účinkem testované látky. Tato kontrola se doporučuje, aby se eliminovaly experimentální chyby, ale při vyhodnocování cytotoxicity nebo fototoxicity se tyto záznamy nepoužijí.
Test příjmu neutrální červeně (NR)
Buňky se promyjí objemem 150 μl předehřátého EBSS/PBS. Promývací roztok se odstraní jemným poklepem. Přidá se 100 μl média s NR a inkubuje se při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 7,5 % CO₂ po dobu 3 hodin.
Po inkubaci se médium s NR odstraní a buňky se promyjí objemem 150 μl EBSS/PBS, jenž se pak zcela a důkladně odstraní (je také možno destičky zcentrifugovat v obrácené poloze).
Přidá se přesně 150 μl roztoku na uvolnění NR (čerstvě připravená směs ethanol/kyselina octová).
Mikrotitrační destičky se po dobu 10 minut rychle třepou na třepačce, dokud se NR z buněk nevyextrahuje a nevytvoří se homogenní roztok.
Na spektrofotometru se změří optická hustota extraktu NR při 540 nm za použití slepého pokusu jako srovnávacího roztoku. Údaje se uchovají ve vhodném formátu (např. ASCII) pro další analýzu.