1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství7a).
Tato zkušební metoda byla navržena za účelem získání informací, které jsou nezbytné ke schválení nebo k další charakterizaci potenciální neurotoxicity chemických látek u dospělých pokusných zvířat. Tuto metodu lze buď kombinovat s již existujícími zkušebními metodami pro studium toxicity po opakovaných dávkách, nebo ji lze provést jako samostatnou zkoušku. Pro usnadnění plánování studií založených na této zkušební metodě se doporučuje prostudovat Doporučení OECD o strategiích a metodách zkoušení neurotoxicity (OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods)7a). To je zvláště důležité tehdy, je-li třeba zvážit změnu sledování a zkušebních postupů, jak jsou doporučeny pro rutinní používání této metody. Doporučení byla připravena pro usnadnění výběru zkušebních postupů pro specifické podmínky použití. Posouzení vývojové neurotoxicity není předmětem této metody.
1.1 ÚVOD
Při posuzování a vyhodnocování toxických vlastností chemických látek je velmi důležité zvážit potenciál neurotoxických účinků. Již metoda zkoušení systémové toxicity po opakované dávce obsahuje sledování, která mají odkrýt potenciální neurotoxicitu. Předloženou zkušební metodu lze používat při plánování studie za účelem získání dalších informací o neurotoxických účincích zjištěných při studii systémové toxicity po opakovaných dávkách, nebo pro jejich potvrzení. Z úvah o potenciální neurotoxicitě určitých druhů chemických látek však může vyplynout, že by mohla být vhodněji posouzena pomocí této metody, pokud neexistují údaje o potenciální neurotoxicitě ze studií systémové toxicity po opakovaných dávkách. Tyto úvahy zahrnují například
• pozorování neurologických příznaků nebo neuropatologických lézí v jiných studiích toxicity než studiích systémové toxicity po opakovaných dávkách, nebo
• strukturní podobnost nebo jiné informace, které posuzovanou látku váží se známými neurotoxickými látkami.
Kromě toho mohou existovat i další případy, kdy je použití této metody vhodné; další podrobnosti jsou uvedeny v literatuře.7a)
Tato metoda byla navržena tak, aby ji bylo možné přizpůsobit zvláštním potřebám při potvrzování specifické histopatologické a behaviorální neurotoxicity chemických látek a při charakterizaci a kvantifikaci neurotoxických účinků.
Dříve se za neurotoxicitu považovaly neuropatie zahrnující neuropatologické leze nebo neurologické dysfunkce, jako např. záchvaty, ochrnutí nebo třes. I když jsou neuropatie významným projevem neurotoxicity, dnes je již jasné, že existují mnohé další příznaky toxicity pro nervový systém (např. ztráta motorické koordinace, senzorické výpadky, poruchy učení a paměti), které se nemusí projevovat ani neuropatií, ani v jiných typech zkoušek.
Tato metoda zkoušení neurotoxicity je navržena tak, aby odhalovala závažné neurobehaviorální a neuropatologické účinky na dospělé hlodavce. Zatímco behaviorální účinky i při nepřítomnosti morfologických změn mohou odrážet nepříznivý vliv na organismus, neznamená to, že všechny behaviorální změny jsou specifické pro nervový systém. Z tohoto důvodu by se měly jakékoliv zjištěné změny vyhodnotit v korelaci s histopatologickými, hematologickými nebo biochemickými výsledky. Zkoušení požadované v této metodě za účelem charakterizace a kvantifikace neurotoxických odpovědí zahrnuje specifické histopatologické a behaviorální postupy, které lze navíc podpořit elektrofyziologickým nebo biochemickým vyšetřením7a).
Neurotoxické látky mohou působit na množství cílových struktur v rámci nervového systému a prostřednictvím různých mechanismů. Protože neexistuje jediná sada zkoušek pro posouzení neurotoxického potenciálu u všech látek, může být nezbytné využít dalších zkoušek in vivo nebo in vitro, které jsou specifické pro typ pozorované nebo očekávané neurotoxicity.
Tuto zkušební metodu lze použít také společně s doporučeními OECD o strategiích a metodách testování neurotoxicity (OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods)7a) při plánování zkoušek určených k další charakterizaci nebo zvýšení citlivosti kvantifikace vztahu dávka-odezva s cílem lépe odhadnout úroveň nevyvolávající pozorovatelné nepříznivé účinky, anebo potvrdit známá nebo očekávaná rizika chemických látek. Lze například navrhnout zkoušky, které by identifikovaly a zhodnotily neurotoxický mechanismus (neurotoxické mechanismy) nebo doplnily údaje, které již byly získány základními neurobehaviorálními a neuropatologickými vyšetřovacími postupy. Takové studie nemusí replikovat údaje použitím standardních postupů doporučených v této metodě, jsou-li takové údaje již k dispozici a nepovažují se za nezbytné k interpretaci výsledků z této studie.
Používá-li se tato zkouška neurotoxicity samotná nebo v kombinaci, poskytuje informace, které mohou
— určit, zda zkoušené chemické látky ovlivňují nervový systém trvale, nebo vratně,
— přispět k charakterizaci změn nervového systému spojených s expozicí chemické látce a přispět k pochopení mechanismů účinku,
— stanovit vztahy mezi dávkou a odezvou a časem a odezvou s cílem odhadnout úroveň nevyvolávající pozorovatelné nepříznivé účinky (NOAEL) (kterou lze použít pro vytvoření bezpečnostních kritérií pro chemickou látku).
Tato zkušební metoda používá orální aplikaci zkušební látky. Jiné typy aplikace (např. kožní nebo inhalační) mohou být vhodnější a mohou si také vyžádat modifikaci doporučovaných postupů. Výběr způsobu aplikace závisí na způsobu expozice člověka a na dostupných toxikologických nebo kinetických informacích.
1.2 DEFINICE
Nepříznivý účinek: je jakákoliv změna spojená s aplikací, která snižuje schopnost organismu přežít, rozmnožovat se nebo se přizpůsobit prostředí.
Neurotoxicita: je nepříznivá změna struktury nebo funkce nervového systému, která je výsledkem expozice chemickému, biologickému nebo fyzikálnímu činiteli.
Neurotoxické agens: je jakýkoliv chemický, biologický nebo fyzikální činitel, který má neurotoxický potenciál.
1.3 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Zkoušená chemická látka se podává orálně v různých dávkách několika skupinám pokusných hlodavců. Obvykle se vyžaduje podávání opakovaných dávek a dávkovací režim může být buď 28 denní, nebo subchronický (90 dnů), nebo chronický (1 rok nebo déle). Postupy stanovené v této zkušební metodě lze použít i při studii akutní neurotoxicity. Pokusná zvířata jsou testována za účelem zjištění nebo charakterizace behaviorálních nebo neurologických odchylek. Během každého pozorovacího období se hodnotí řada znaků chování, které by mohly být ovlivněny neurotoxickými látkami. Na konci zkoušky se u podskupiny pokusných zvířat obou pohlaví z každé skupiny provede perfuze in situ a připraví se a vyšetří řezy mozku, míchy a periferních nervů.
Pokud se zkouška provádí jako samostatná zkouška pro vyšetření neurotoxicity nebo charakterizaci neurotoxických účinků, lze pokusná zvířata z každé skupiny, která nebyla použitá k perfuzi a k následnému histopatologickému vyšetření (viz tabulka 12), použít ke specifickým neurobehaviorálním, neuropatologickým, neurochemickým nebo elektrofyziologickým vyšetřením, která mohou doplnit údaje získané ze standardních vyšetření vyžadovaných v této metodě7a). Tyto doplňující postupy mohou být zvláště užitečné tehdy, jestliže empirická pozorování nebo předpokládané účinky naznačují specifický typ nebo cílovou strukturu neurotoxicity chemické látky. Zbývající pokusná zvířata lze případně použít k některým jiným hodnocením, jako jsou např. hodnocení požadovaná ve zkušebních metodách u studií toxicity po opakovaných dávkách na hlodavcích.
Pokud se postupy této zkušební metody kombinují s postupy z jiných zkušebních metod, je nezbytný dostatečný počet pokusných zvířat, aby byly splněny požadavky pro pozorování v obou studiích.
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
1.4.1 Výběr živočišných druhů
Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, i když lze po odpovídajícím zdůvodnění použít i jiné druhy hlodavců. Použity by měly být běžně používané laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých pokusných zvířat. Samice musí být nullipary a nesmějí být březí. Podávání látky by mělo začít co nejdříve po odstavení, nejlépe když pokusná zvířata dosáhnou stáří šesti týdnů a v každém případě dříve, než dosáhnou stáří devíti týdnů. Pokud se však tato zkouška kombinuje s dalšími zkouškami, je možné, že požadavky týkající se stáří pokusných zvířat budou vyžadovat určité změny. Na začátku studie by měl být u používaných pokusných zvířat jen minimální rozptyl hmotnosti a neměl by překročit 20 % průměrné hmotnosti u jednotlivých pohlaví. Pokud se před dlouhodobou studií provádí orientační krátkodobá studie toxicity po opakovaných dávkách, je třeba u obou studií použít pokusná zvířata ze stejných kmenů a stejného zdroje.
1.4.2 Podmínky chovu a krmení
Teplota ve zkušební místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C. Relativní vlhkost by měla být alespoň 30 %, neměla by však překročit 70 % během čištění místnosti a cílem je hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Náhlé hlasité zvuky je třeba omezit na minimum. Ke krmení by se mělo používat obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezeným přísunem pitné vody. Na výběr krmiva může mít vliv nutnost zajistit vhodnou přísadu pro zkoušenou látku, je-li látka podávána touto metodou. Pokusná zvířata lze chovat jednotlivě, anebo je lze umístit v klecích v malých skupinkách tvořených pokusnými zvířaty stejného pohlaví v souladu s příslušným právním předpisem,10) pokud není stanoveno projektem pokusů jinak.
1.4.3 Příprava pokusných zvířat
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu10). Pokusná zvířata by měla být náhodně rozdělena do kontrolních a experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Jednotlivá pokusná zvířata se jednoznačně identifikují a umístí se do klecí nejméně pět dnů před začátkem studie, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky.
1.4.4 Způsob aplikace a příprava dávek
V této zkušební metodě se jedná konkrétně o orální způsob aplikace zkoušené látky. Orální aplikaci lze provádět prostřednictvím žaludeční sondy, krmiva, pitné vody nebo tobolek. Použít lze i jiné způsoby aplikace (např. kožní nebo inhalační), které si mohou vyžádat modifikaci doporučených postupů. Výběr způsobu aplikace závisí na typu expozice člověka a na dostupných toxikologických nebo kinetických informacích. Je třeba uvést důvody pro výběr způsobu aplikace a odpovídající modifikace postupů v rámci této zkušební metody.
Zkoušená látka se podle potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporučuje se zvážit použití vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku/suspenze v jiném vehikulu. Je třeba znát toxikologické charakteristiky vehikula. Kromě toho je třeba věnovat pozornost následujícím typickým znakům vehikula: účinku na absorpci, distribuci, metabolismus nebo retenci zkoušené látky a dále účinku na chemické vlastnosti zkoušené látky, které mohou pozměnit její toxické charakteristiky, a účinku na spotřebu krmiva nebo vody anebo nutriční stav pokusných zvířat.
1.5 POSTUPY
1.5.1 Počet a pohlaví pokusných zvířat
Pokud se studie provádí jako samostatná studie, je třeba použít v každé dávkové a kontrolní skupině alespoň 20 pokusných zvířat (10 samic a 10 samců) pro vyhodnocení podrobných klinických a funkčních pozorování. Alespoň u pěti samců a pěti samic vybraných z těchto deseti samců a samic je třeba na konci zkoušky provést perfuzi in situ a použít je k podrobnému neurohistopatologickému vyšetření. V případě, kdy jsou v dané dávkové skupině pozorovány příznaky neurotoxických účinků pouze u omezeného počtu pokusných zvířat, je třeba zvážit přiřazení těchto pokusných zvířat k pokusným zvířatům vybraným pro perfuzi. Pokud se studie provádí v kombinaci se studií toxicity po opakovaných dávkách, je třeba použít odpovídající počet pokusných zvířat, aby bylo možné splnit cíle obou studií. Minimální počet pokusných zvířat na skupinu u nejrůznějších kombinací studií je uveden v tabulce 12. Pokud se plánuje utracení ve vložených intervalech nebo vytvoření reparační skupiny ke sledování vratných účinků, perzistence nebo zpožděného výskytu toxických účinků po skončení aplikace, nebo se zvažují dodatečná sledování, je třeba zvýšit počet pokusných zvířat, aby se zajistil dostatečný počet pokusných zvířat požadovaných ke sledování a k histopatologickému vyšetření.
1.5.2 Experimentální a kontrolní skupina
Obecně by měly být použity nejméně tři experimentální a jedna kontrolní skupina; pokud se však podle jiných údajů neočekávají žádné účinky po opakovaných dávkách 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti na den, může být provedena limitní zkouška. Nejsou-li k dispozici žádné vhodné údaje, může být provedena předběžná studie pro stanovení rozpětí dávek, které mají být použity. S výjimkou aplikace zkoušené látky je třeba s pokusnými zvířaty v kontrolní skupině zacházet naprosto stejným způsobem, jako s pokusnými zvířaty v experimentální skupině. Pokud se při podávání zkoušené látky používá vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu.
1.5.3 Kontrola spolehlivosti
Laboratoř provádějící zkoušku by měla předložit údaje prokazující její způsobilost pro uskutečnění zkoušky a citlivost používaných postupů. Takové údaje by měly poskytnout důkaz o schopnosti odhalit a popřípadě kvantifikovat změny v různých ukazatelích doporučených ke sledování, jako jsou např. vegetativní příznaky, reaktivita na smyslové podněty, síla úchopu a motorická aktivita. Informace o chemických látkách, které způsobují různé typy neurotoxických reakcí a které jsou vhodné jako pozitivní kontrolní látky, lze nalézt v literatuře7a). Historické údaje lze použít tehdy, pokud zůstanou stejné základní aspekty experimentálních postupů. Doporučuje se pravidelná aktualizace historických údajů. Nové kontrolní údaje by měly být doplněny tehdy, pokud provádějící laboratoř v průběhu zkoušky změní některý základní prvek provádění zkoušky nebo postupu.
1.5.4 Výběr dávky
Úrovně dávek je třeba vybrat s ohledem na předchozí zjištěnou toxicitu a kinetické údaje dostupné pro zkoušenou sloučeninu nebo podobné látky. Nejvyšší úroveň dávky se zvolí tak, aby vyvolala neurotoxické nebo jasné systémové toxické účinky, aby bylo možné prokázat závislost odpovědi na dávkách a úroveň dávky bez pozorovatelného nepříznivého účinku (NOAEL), zvolí se sestupná posloupnost úrovní dávek. V zásadě je třeba stanovit úrovně dávek tak, aby bylo možné odlišit primární toxické účinky na nervový systém od systémové toxicity. Obvykle jsou optimální dva až tři intervaly a často je vhodnější přidání čtvrté zkušební skupiny než používání velkých intervalů mezi jednotlivými dávkami (např. lišících se faktorem 10). Rovněž je třeba vzít v úvahu i odhad úrovně expozice u člověka, je-li k dispozici.
1.5.5 Limitní zkouška
Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti na den nevyvolá pozorovatelné neurotoxické účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není nezbytné provádět kompletní studii za použití tří úrovní dávek. V některých případech předpokládaná expozice u člověka si vyžádá použití vyšší orální dávky v limitní zkoušce. U dalších způsobů podávání látky, jako je inhalační nebo kožní aplikace, může být maximální dosažitelná úroveň expozice dána fyzikálně-chemickými vlastnostmi zkoušené látky. Při provedení akutní zkoušky orálně by dávka pro limitní zkoušku měla být alespoň 2 000 mg/kg.
1.5.6 Aplikace dávek
Zkoušená látka se podává pokusným zvířatům denně, 7 dnů v týdnu, po dobu alespoň 28 dnů. Použití 5 denního dávkovacího režimu nebo kratší expozice je třeba zdůvodnit. Je-li látka podávána prostřednictvím žaludeční sondy, měla by se podávat v jedné dávce pomocí sondy nebo vhodné intubační kanyly. Maximální množství tekutiny, které lze jednorázově podávat, závisí na velikosti pokusného zvířete. Objem by neměl překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti. V případě vodných roztoků je však možné zvážit i použití až 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Kromě dráždivých nebo žíravých látek, které při vyšších koncentracích obvykle vyvolají prudké účinky, by se měly změny množství zkoušené látky minimalizovat upravením koncentrace, aby se na všech úrovních dávek zajistilo konstantní množství.
U látek podávaných prostřednictvím krmiva nebo pitné vody je velmi důležité zajistit, aby množství použité zkoušené látky neovlivnilo vyváženost běžného krmiva nebo příjmu vody. Je-li zkoušená látka podávána v krmivu, je třeba používat buď konstantní dietní koncentrace (v ppm), nebo konstantní úrovně dávky, pokud jde o tělesnou hmotnost pokusného zvířete. Použití jiné alternativy je třeba zdůvodnit. U látky podávané prostřednictvím žaludeční sondy je třeba dávku podávat každý den přibližně ve stejnou dobu a alespoň jednou týdně je třeba dávku přizpůsobit tak, aby se udržela konstantní úroveň dávky vzhledem k tělesné hmotnosti pokusného zvířete. Provádí-li se studie opakovaného podávání látky jako předběžná studie pro dlouhodobou studii, mělo by být v obou studiích používáno stejné krmivo. Není-li u akutní studie možnost podávání dávky v celku, je třeba podávat dávku po menších částech po dobu, která by neměla překročit 24 h.
1.6 POZOROVÁNÍ
1.6.1 Četnost pozorování a zkoušek
U studií s opakovanou dávkou by doba pozorování měla pokrýt celé dávkovací období. U studií akutní toxicity pozorování pokračuje ještě 14 dnů po skončení aplikace. U pokusných zvířat v satelitních skupinách, která jsou v období po skončení aplikace chována bez expozice, by pozorování mělo pokrýt i toto období.
Pozorování je třeba provádět dostatečně často, aby bylo možné odhalit jakékoli behaviorální nebo neurologické abnormality s co největší pravděpodobností. Pozorování se provádí denně, pokud možno ve stejnou dobu a s přihlédnutím k době očekávaného maxima účinku po podání látky. Četnost klinických pozorování a funkčních zkoušek je shrnuta v tabulce 13. Pokud kinetické nebo jiné údaje získané z předchozích studií naznačují potřebu zvolit časové body pozorování nebo zkoušek nebo období po skončení pozorování, je nutné zvolit takový náhradní plán, na jehož základě lze získat maximální množství informací. Změny plánu je třeba zdůvodnit.
1.6.1.1 Pozorování celkového zdravotního stavu a mortality/morbidity
U všech pokusných zvířat se alespoň jednou denně pečlivě kontroluje jejich zdravotní stav a nejméně dvakrát denně se provede prohlídka všech pokusných zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality.
1.6.1.2 Podrobná klinická pozorování
Podrobná klinická pozorování se provedou u všech pokusných zvířat vybraných k těmto účelům (viz tabulka 12) nejprve před první expozicí (aby bylo možné intraindividuální srovnání) a poté v různých intervalech podle trvání studie (viz tabulka 13). Podrobná klinická pozorování u satelitních zotavovacích skupin se provedou na konci zotavovacího období. Podrobná klinická pozorování se provádějí mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru. Pozorování se pečlivě zaznamenají pomocí systémů hodnocení, které zahrnují kritéria nebo bodovací stupnice pro jednotlivá měření v rámci pozorování. Používaná kritéria nebo stupnice musí být explicitně definovány zkušební laboratoří. Je třeba dbát na to, aby byly rozdíly ve zkušebních podmínkách co nejmenší (a nesouvisely systematicky s aplikací) a aby vyšetření prováděly osoby, které nejsou informovány o skupině, do které pokusné zvíře patří.
Doporučuje se provádět pozorování strukturovaně, přičemž se u každého pokusného zvířete při každém pozorování systematicky používají jasně definovaná kritéria (včetně definice normálního „rozpětí“). „Normální rozpětí“ je třeba dostatečně zdokumentovat. Všechny pozorované příznaky se zaznamenají. Je-li to možné, zaznamená se rovněž závažnost pozorovaných příznaků. Klinická pozorování zahrnují kromě změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a exkretů a autonomních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklý průběh dýchání nebo dýchání ústy, nezvyklé příznaky močení nebo defekace a zbarvení moči).
Zaznamenají se rovněž nezvyklé projevy, pokud jde o polohu těla, úroveň aktivity (např. snížené nebo zvýšené zkoumání standardního pozorovacího prostoru) a koordinaci pohybu. Zaznamenají se také změny chůze (např. kolébání, ataxie), polohy (nahrbení hřbetu) a reakce na manipulaci, umístění a další stimuly související s prostředím, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, křečí nebo třesu, stereotypů v chování (např. nadměrného čištění, nezvyklých pohybů hlavy nebo opakovaného kroužení) nebo zvláštního chování (např. kousání nebo nadměrného olizování, sebepoškozování, pohybu pozpátku, vydávání zvuků) anebo agresivity.
1.6.1.3 Funkční zkoušky
Podobně jako podrobná klinická pozorování se u jednotlivých pokusných zvířat vybraných k těmto účelům provedou i funkční zkoušky - nejprve před expozicí a potom vícekrát po jejím provedení (viz tabulka 12). Četnost funkčního testování závisí rovněž na trvání studie (viz tabulka 13). Mimo dobu pozorování stanovenou v tabulce 13 se provede také funkční pozorování satelitní zotavovací skupiny, a to těsně před plánovaným utracením. Funkční zkoušky zahrnují reakce na různé smyslové podněty [např. sluchové, zrakové a dotykové (případně taktilní) podněty7a)], hodnocení síly stisku7a) a hodnocení motorické aktivity7a). Motorická aktivita se měří pomocí automatického přístroje schopného odhalit jak snížení, tak i zvýšení této aktivity. Pokud se použije jiný systém, měl by být kvantitativní a je třeba prokázat jeho citlivost a spolehlivost. Každý přístroj je nutné otestovat, aby se zajistila jeho spolehlivost po celé časové období a homogenita s ostatními přístroji. Další podrobnosti o postupech, kterými se lze řídit, jsou uvedeny v příslušných odkazech. Pokud neexistují žádné údaje (např. údaje o vztahu mezi strukturou a biologickou aktivitou, epidemiologické údaje, jiné toxikologické studie), které by ukazovaly na potenciální neurotoxické účinky, je nutné za účelem podrobnějšího vyšetření těchto možných účinků zvážit začlenění specializovanějších zkoušek smyslových a motorických funkcí nebo učení a paměti. Další informace o specializovanějších zkouškách a jejich používání je uvedeno v literatuře.7a)
Ve výjimečných případech lze pokusná zvířata vykazující známky toxicity v takové míře, která by významně narušila provedení funkční zkoušky, z této zkoušky vyřadit. Vyřazení těchto pokusných zvířat z funkčních zkoušek je nutné zdůvodnit.
1.6.2 Tělesná hmotnost a spotřeba krmiva a vody
U studií s délkou trvání do 90 dnů se všechna pokusná zvířata váží alespoň jednou týdně a každý týden se rovněž provádí měření spotřeby krmiva (měření spotřeby vody se provádí tehdy, je-li zkoušená látka aplikována prostřednictvím tohoto média). U dlouhodobých studií se všechna pokusná zvířata váží alespoň jednou týdně během prvních 13 týdnů a poté alespoň jednou za 4 týdny. Během prvních 13 týdnů se měří spotřeba krmiva (měření spotřeby vody se provádí tehdy, je-li zkoušená látka aplikována prostřednictvím tohoto média) a poté přibližně v tříměsíčních intervalech, pokud si změny zdravotního stavu nebo změny tělesné hmotnosti nevyžádají jiný interval.
1.6.3 Oftalmologické vyšetření
U studií delších než 28 dnů se před aplikací zkoušené látky a před ukončením studie provede oftalmologické vyšetření pomocí oftalmoskopu nebo jiného vhodného nástroje, a to nejlépe u všech pokusných zvířat, alespoň však u všech pokusných zvířat ze skupin s vysokou dávkou a z kontrolních skupin. Pokud se zjistí změny na očích nebo pokud klinické příznaky ukazují na nutnost vyšetření očí, vyšetří se všechna pokusná zvířata. U dlouhodobých studií se oftalmologické vyšetření provede ve 13. týdnu stáří pokusných zvířat. Oftalmologická vyšetření není nutné provádět tehdy, jsou-li již k dispozici údaje z jiných podobně dlouhých studií s podobnými úrovněmi dávek.
1.6.4 Hematologické a biochemické vyšetření
Pokud se studie neurotoxicity provádí v kombinaci se studií systémové toxicity po opakované dávce, provede se hematologické vyšetření a stanovení klinických biochemických parametrů tak, jak je uvedeno v příslušné metodě studie systémové toxicity. Odebírání vzorků se provede tak, aby se minimalizovaly jakékoliv účinky na nervový systém a chování.
1.6.5 Histopatologie
Neuropatologické vyšetření se navrhne tak, aby doplnilo a rozšířilo pozorování provedená v rámci této studie během fáze in vivo. Tkáně alespoň 5 pokusných zvířat každého pohlaví z každé skupiny (viz tabulka 12 a další odstavec) se fixují in situ za použití obecně uznávaných perfuzních a fixačních technik.7a) Zaznamenají se jakékoliv výrazné změny. Pokud se studie provádí jako samostatná studie neurotoxicity nebo studie charakterizující neurotoxické účinky, lze použít zbytek pokusných zvířat buď ke specifickým neurobehaviorálním,7a) neuropatologickým,7a) neurochemickým,7a) nebo elektrofyziologickým7a) postupům, které mohou doplnit zde popsané postupy a vyšetření, anebo zvýšit počet subjektů vyšetřovaných k histopatologickým účelům. Tyto doplňkové postupy jsou zvláště užitečné tehdy, pokud empirická pozorování nebo očekávané účinky ukazují na specifický typ nebo cílovou strukturu neurotoxicity.7a) Je také možné zbytek pokusných zvířat použít k běžným patologickým hodnocením, která jsou popsána v metodě studie po opakované dávce.
U všech tkáňových vzorků zalitých parafínem se provede běžný postup barvení, např. pomocí hematoxylinu a eosinu (H&E), a mikroskopické vyšetření. Jsou-li pozorovány nebo existuje-li podezření na příznaky periferní neuropatie, vyšetří se vzorky periferních nervů zalitých do pryskyřic (vosků). Klinické příznaky mohou rovněž poukázat na další místa, která je nutné vyšetřit, nebo na nutnost použít speciální postupy barvení. Pokyny k určení dalších míst, která je třeba vyšetřit, lze nalézt v literatuře7a). K prokázání charakteristických typů patologické změny může přispět i odpovídající speciální barvení7a).
U reprezentativních řezů centrálního a periferního nervového systému se provede histologické vyšetření.7a) Mezi vyšetřované oblasti obvykle patří: přední mozek, střední část mozku, včetně řezu hippocampem, střední mozek, mozeček, Varolův most, prodloužená mícha, oko se zrakovým nervem a sítnicí, mícha v oblasti cervikálního a lumbálního zesílení, dorsální kořenová ganglia, dorsální a ventrální kořenová vlákna, proximální část n. ischiadicus a proximální část n. tibialis (v oblasti kolena) a n tibialis z oblasti lýtkového svalu. Řezy míchy a periferních nervů by měly zahrnovat jak příčné, tak i podélné řezy. Pozornost je nutné věnovat uspořádání cév v oblasti nervového systému. Rovněž se vyšetří vzorky z kosterního svalstva, a to zvláště z lýtkového svalu. Zvláštní pozornost je nutné věnovat místům s buněčnou a vláknitou strukturou a těm strukturám v oblasti CNS a PNS, o nichž je známo, že na ně mají neurotoxické látky velký vliv.
Informace o neuropatologických změnách, které obvyklé vyplývají z expozice toxickým látkám, lze nalézt v literatuře.7a) Doporučuje se postupné vyšetření tkáňových vzorků, při kterém se porovnají nejprve vzorky řezů ze skupiny s vysokou dávkou se vzorky řezů z kontrolní skupiny. Nejsou-li ve vzorcích z těchto skupin zjištěny žádné neuropatologické změny, není třeba provádět další analýzu. Jsou-li zjištěny ve skupině s vysokou dávkou neuropatologické změny, je třeba následně okódovat a vyšetřit vzorky ze všech potenciálně zasažených tkání ze skupin se střední a nízkou dávkou.
Pokud je během kvalitativního vyšetření zjištěna přítomnost neuropatologických změn, provede se druhé vyšetření všech oblastí nervového systému, které vykazují tyto změny. Okódují se řezy ze všech dávkových skupin ze všech potenciálně zasažených oblastí a vyšetří v náhodném pořadí bez znalostí kódu. Zaznamená se četnost a závažnost všech lézí. Po zhodnocení všech oblastí ze všech dávkových skupin se kód odkryje a provede se statistická analýza za účelem vyhodnocení vztahu dávka-odezva. U každé leze se popíší příklady různých stupňů závažnosti.
Neuropatologické výsledky se vyhodnotí v kontextu s pozorováním a měřením chování a rovněž spolu s dalšími údaji z předchozích a souběžných studií systémové toxicity zkoušené látky.