1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství^7a).

1.1 ÚVOD
Při přípravě této aktualizované metody byla zvláštní pozornost věnována možným zlepšením v oblasti dobrého zacházení s pokusnými zvířaty a hodnocení veškerých existujících informací o zkoušené látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na pokusných zvířatech. Součástí této metody je doporučení, aby před provedením popsané zkoušky dráždivých a leptavých účinků látky na kůži in vivo byla vypracována analýza průkaznosti stávajících relevantních údajů. Pokud jsou k dispozici nedostatečné údaje, lze je rozpracovat využitím metody postupného zkoušení.^7a) Strategie zkoušení zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek in vitro a je popsána v tabulce 8 k této metodě. Navíc se v případě potřeby v počáteční zkoušce in vivo doporučuje namísto současného aplikování postupná aplikace tří testovacích náplastí.
V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení s pokusnými zvířaty by se zkoušky in vivo neměly provádět, dokud nebyly všechny dostupné údaje významné pro potenciální leptavé nebo dráždivé účinky látky vyhodnoceny na základě analýzy průkaznosti výsledků. Takové údaje budou zahrnovat důkazy ze stávajících studií na lidech nebo pokusných zvířatech, důkazy leptavých nebo dráždivých účinků jedné nebo více strukturně příbuzných látek nebo směsí takových látek, údaje dokládající silnou kyselost nebo zásaditost látky^7a) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek in vitro nebo ex vivo^7a). Tato analýza by měla snížit potřebu zkoušek leptavých nebo dráždivých účinků na kůži metodou in vivo u látek, u nichž již existují důkazy z jiných studiích, pokud jde o tyto dva ukazatele.
V tabulce 8 k této metodě je uvedena upřednostňovaná strategie postupného zkoušení, jejíž součástí je provedení validovaných a uznaných zkoušek leptavých/dráždivých účinků in vitro nebo ex vivo. Tato strategie byla vypracována na semináři OECD^7a), jeho účastníky jednohlasně doporučena a přijata jako doporučená strategie zkoušení v globálně harmonizovaném systému klasifikace chemických látek (GHS)^7a). Doporučuje se, aby se podle této strategie zkoušení postupovalo před provádění zkoušek in vivo. U nových látek se doporučuje metoda zkoušení po krocích, díky níž lze dosáhnout vědecky spolehlivých údajů o leptavých/dráždivých účincích látky. U existujících látek, o jejichž leptavých/dráždivých účincích na kůži není k dispozici dostatek údajů, by se měla tato strategie využít pro doplnění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu po krocích musí být odůvodněno.
Pokud pomocí analýzy průkaznosti výsledků nelze o leptavých nebo dráždivých účincích rozhodnout, měla by se v souladu se strategií postupného zkoušení uvážit zkouška in vivo (viz tabulka 8).

1.2 DEFINICE
Dráždivé účinky na kůži: vyvolání vratných změn na kůži do 4 h po aplikaci zkoušené látky.
Leptavé účinky na kůži: vyvolání nevratného poškození kůže, zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do čtyř hodin po aplikaci zkoušené látky. Reakce po poleptání se projevují vředy, krvácením, krvavými strupy a v závěru čtrnáctidenního pozorování ztrátou barvy v důsledku vyblednutí kůže, úplnými ložisky alopecie a jizvami. K vyhodnocení sporných lézí by se měla uvážit histopatologie.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Látka, která má být zkoušena, se v jedné dávce nanese na kůži pokusného zvířete, přičemž oblasti neexponované kůže pokusného zvířete slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se určí, vyhodnotí a následně popíše stupeň dráždivých/leptavých účinků, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků.
Pokusná zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují přetrvávající příznaky značného utrpení nebo bolesti, se humánně utratí a látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o utracení umírajících a závažně trpících pokusných zvířat lze nalézt v literatuře^7a).

1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1 Příprava na zkoušku in vivo

1.4.1.1 Výběr druhu pokusných zvířat
Upřednostňovaným pokusným zvířetem je albín králíka a používají se mladá dospělá pokusná zvířata. Při použití jiného druhu by se mělo podat zdůvodnění.

1.4.1.2 Příprava pokusných zvířat
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu¹⁰).
Asi 24 h před zahájením zkoušky se pokusným zvířatům ostříhá srst na zádech. Je třeba dbát na to, aby se kůže neporanila. Smějí se použít pouze pokusná zvířata se zdravou, neporaněnou kůží.
Některé kmeny králíka mají plošky husté srsti, které jsou v některých obdobích roku výraznější. Na takových oblastech husté srsti by se zkouška provádět neměla.

1.4.1.3 Podmínky chovu a krmení
Pokusná zvířata by měla být chována samostatně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla u králíků být (20 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla činit minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách v souladu s příslušným právním předpisem¹⁰), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete.

1.4.2 Postup zkoušky

1.4.2.1 Aplikace zkoušené látky
Zkoušená látka se nanese na malou plochu kůže (asi 6 cm²) a pokryje se plátkem mulu s nedráždivou náplastí. V případech, kdy přímá aplikace není možná (např. kapaliny nebo některé pasty), by se měla zkoušená látka nejprve nanést na plátek mulu, který se následně přiloží na kůži. Po dobu trvání expozice je třeba přidržovat plátek volně na kůži vhodným semiokluzivním obvazem. Pokud se zkoušená látka nanáší na mul, měl by být na kůži připevněn tak, aby se zajistil dobrý styk s kůží a rovnoměrné rozložení látky na kůži. Je třeba zabránit tomu, aby se pokusné zvíře dostalo k mulu a zkoušenou látku požilo nebo vdechlo.
Kapalné zkoušené látky se zpravidla aplikují neředěné. Při zkouškách pevných látek (které mohou být podle potřeby rozetřeny na prach) se zkoušená látka navlhčí nejmenším množstvím vody (nebo podle potřeby jiným vhodným vehikulem) dostatečným k zajištění dobrého styku s kůží. Pokud se používají jiná vehikula než voda, měl by být potenciální vliv vehikula na dráždivé účinky zkoušené látky na kůži pouze minimální.
Po uplynutí doby expozice, která je obvykle 4 h, se odstraní zbytky zkoušené látky, pokud možno vodou nebo vhodným rozpouštědlem, aniž by došlo k ovlivnění odezvy nebo celistvosti kůže.

1.4.2.2 Úroveň dávek
Na testovací místo se nanese 0,5 ml kapaliny nebo 0,5 g tuhé látky nebo pasty.

1.4.2.3 Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo s použitím jednoho pokusného zvířete)
Důrazně se doporučuje, aby byla zkouška in vivo provedena nejprve na jednom pokusném zvířeti, zejména pokud existuje podezření, že látka má potenciální leptavé účinky. Tento postup je v souladu se strategií postupného zkoušení (viz tabulka 8).
Pokud byla na základě analýzy průkaznosti výsledků látka posouzena jako žíravá, není žádné další zkoušení na pokusných zvířatech nutné. U většiny látek, u nichž je podezření, že jsou žíravé, nejsou obvykle další zkoušky in vivo nezbytné. Avšak v těch případech, kde je kvůli nedostatku důkazů považováno za nezbytné zjistit další údaje, mohou být v omezené míře provedeny zkoušky na pokusných zvířatech podle tohoto postupu: pokusnému zvířeti se postupně přiloží nejvýše tři testovací náplasti. První náplast se odstraní po třech minutách. Pokud není pozorována závažná kožní reakce, odstraní se druhá náplast po jedné hodině. Pokud pozorování v této fázi naznačují, že expozici lze bez porušení zásady humánního zacházení prodloužit na čtyři hodiny, přiloží se třetí náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní, a vyhodnotí se odezva.
Pokud je po některé ze tří následných expozic pozorován leptavý účinek, zkouška se okamžitě ukončí. Pokud po odstranění třetí náplasti není leptavý účinek pozorován, pokusné zvíře se pozoruje podobu 14 dnů, pokud se u něj poleptání kůže neprojeví dříve.
V takových případech, kdy se u zkoušené látky nepředpokládá, že vyvolá leptavé účinky, ale může být dráždivá, by se měla jednomu pokusnému zvířeti přiložit jedna náplast na čtyři hodiny.

1.4.2.4 Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na kůži in vivo s dalšími pokusnými zvířaty)
Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na dvou dalších pokusných zvířatech, u každého s jednou náplastí s dobou expozice 4 h. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován dráždivý účinek, lze potvrzující zkoušku provést postupně, nebo exponováním dvou dalších pokusných zvířat současně. Ve výjimečném případě, kdy se počáteční zkouška neprovádí, lze dvěma nebo třem pokusným zvířatům přiložit jednu náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní. Jestliže se použijí dvě pokusná zvířata a u obou se projeví stejná reakce, není žádné další zkoušení nutné. Jinak se zkouší také třetí pokusné zvíře. Sporné reakce může být nutné zhodnotit na dalších pokusných zvířatech.

1.4.2.5 Doba pozorování
Doba pozorování by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena kdykoliv v okamžiku, kdy pokusné zvíře vykazuje přetrvávající příznaky značné bolesti nebo utrpení. Za účelem určení vratnosti účinků by se pokusná zvířata měla pozorovat 14 dnů po odstranění náplastí. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 14 dnů, zkouška by se měla v tomto okamžiku ukončit.

1.4.2.6 Klinická pozorování a hodnocení reakcí kůže
Všechna pokusná zvířata se pozorují na příznaky erytému a edému a reakce kůže se hodnotí po 60 min a dále po 24, 48 a 72 h po odstranění náplasti se zkoušenou látkou. V počáteční zkoušce na jednom pokusném zvířeti se po odstranění náplasti okamžitě vyšetří také testovací místo. Kožní reakce se vyhodnotí a zaznamenají podle stupnice v níže uvedené tabulce 9. Pokud se objeví poškození kůže, které po 72 h nelze označit za dráždivé nebo leptavé účinky, může být nezbytné pozorování až do 14. dne kvůli stanovení vratnosti účinků. Vedle pozorování dráždivých účinků by měly být důkladně popsány a zaznamenány veškeré místní toxické účinky, jako je odtučnění kůže a jakékoli systémové nežádoucí účinky (např. vliv na klinické příznaky toxicity a tělesnou hmotnost). Pro objasnění sporných reakcí by se mělo uvážit histopatologické vyšetření.
Hodnocení reakcí kůže je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení reakcí kůže a napomáhat zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování (viz níže uvedená tabulka 9). Jako pomůcku lze použít ilustrované pokyny pro hodnocení dráždivých účinků na kůži a jiných lézí.^7a)