1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství^7a).

1.1 ÚVOD
Při přípravě této aktualizované metody byla zvláštní pozornost věnována možným zlepšením, jichž lze dosáhnout vyhodnocováním veškerých existujících informací o zkoušené látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na pokusných zvířatech a brát tak ohled na dobré zacházení s pokusnými zvířaty. Součástí této metody je doporučení, aby před provedením popsané zkoušky akutních dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo byla vypracována analýza průkaznosti^7a) stávajících relevantních údajů. Pokud jsou k dispozici nedostatečné údaje, doporučuje se je získat pomocí metody postupného zkoušení.^7a) Strategie zkoušení zahrnuje provedení validovaných a schválených zkoušek in vitro a je popsána v tabulce 10 k této metodě zkoušení. Navíc se před zvažováním očního testu in vivo doporučuje provést zkoušku dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo, na jejímž základě se předpoví možné leptavé účinky na oči.
V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a rovněž dobrého zacházení s pokusnými zvířaty by se ke zkouškám in vivo nemělo přistupovat, dokud nebyly všechny dostupné údaje významné pro potenciální leptavé/dráždivé účinky látky na oči vyhodnoceny na základě analýzy průkaznosti výsledků. Takové údaje budou zahrnovat důkazy ze stávajících studií na lidech nebo pokusných zvířatech, důkazy leptavých/dráždivých účinků jedné nebo více strukturně příbuzných látek nebo směsí těchto látek, údaje dokládající vysokou kyselost nebo zásaditost látky^7a) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek leptavých a dráždivých účinků na kůži in vitro nebo ex vivo.^7a) Tyto studie mohly být vypracovány před analýzou průkaznosti výsledků nebo na základě zjištění této analýzy.
U některých látek může taková analýza naznačovat nutnost provedení studií potenciálních leptavých/dráždivých účinků látky na oči in vivo. Ve všech takových případech se před zvážením použití oční zkoušky in vivo nejprve provede studie účinků látky na kůži in vivo a zhodnotí se v souladu s metodou zkoušení B.4^7a). Použití analýzy průkaznosti výsledků a strategie postupného zkoušení by mělo omezit potřebu zkoušení leptavých/dráždivých účinků na oči těch látek, u nichž tyto účinky byly již dostatečně doloženy v jiných studiích. Pokud pomocí strategie postupného zkoušení nelze o možnosti leptavých nebo dráždivých účinků na oči rozhodnout ani po provedení studie leptavých a dráždivých účinků na kůži in vivo, lze provést zkoušku leptavých/dráždivých účinků na oči in vivo.
Upřednostňovaná strategie postupného zkoušení, jejíž součástí je provedení validovaných zkoušek leptavých/dráždivých účinků in vitro nebo ex vivo, je uvedena v tabulce 10 k této metodě zkoušení. Tato strategie byla vypracována na semináři OECD^7a), jeho účastníky jednohlasně doporučena a přijata jako doporučená strategie zkoušení v globálně harmonizovaném systému klasifikace chemických látek (GHS)^7a). Doporučuje se, aby se podle této strategie zkoušení postupovalo před prováděním zkoušek in vivo. U nových látek se doporučuje metoda zkoušení po krocích, díky níž lze dosáhnout vědecky spolehlivých údajů o leptavých/dráždivých účincích látky. U existujících látek, o jejichž leptavých/dráždivých účincích na kůži a oči není k dispozici dostatek údajů, by se měla tato strategie využít pro doplnění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu po krocích musí být odůvodněno.

1.2 DEFINICE
Dráždivé účinky na oči: vyvolání změn v oku po aplikaci zkoušené látky na přední povrch oka. Tyto změny jsou plně vratné do 21 dnů po aplikaci.
Leptavé účinky na oči: vyvolání poškození oční tkáně nebo závažné fyzické zhoršení vidění po aplikaci zkoušené látky na přední povrch oka. Toto poškození není plně vratné do 21 dnů po aplikaci.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Látka, která má být zkoušena, se nanese v jedné dávce na jedno oko pokusného zvířete, přičemž neexponované oko slouží jako kontrola. V určitých intervalech se na základě určení lézí spojivky, rohovky a duhovky vyhodnotí stupeň dráždivých/leptavých účinků na oči. Popíší se také jiné účinky na oko a nežádoucí systémové účinky, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo nevratnost účinků.
Pokusná zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují přetrvávající příznaky značného utrpení nebo bolesti, se humánně utratí a látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o utracení umírajících a závažně trpících pokusných zvířat lze nalézt v literatuře^7a).

1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1 Příprava na zkoušku in vivo

1.4.1.1 Výběr živočišných druhů
Upřednostňovaným pokusným zvířetem je albín králíka a používají se zdravá mladá dospělá pokusná zvířata. Při použití jiných kmenů nebo druhů by se mělo podat zdůvodnění.

1.4.1.2 Příprava pokusných zvířat
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu¹⁰). 24 h před zkouškou se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Pokusná zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky, se nepoužijí.

1.4.1.3 Podmínky chovu a krmení
Pokusná zvířata by měla být chována samostatně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla u králíků činit (20 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla činit minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % během úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách v souladu s příslušným právním předpisem¹⁰), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete.

1.4.2 Postup zkoušky

1.4.2.1 Aplikace zkoušené látky
Zkoušená látka se aplikuje každému pokusnému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na jednu sekundu lehce přidrží u sebe, aby nedošlo ke ztrátě látky. Druhé oko, do kterého se látka neaplikuje, slouží jako kontrola.

1.4.2.2 Výplach
Oči pokusných zvířat se do 24 h po instilaci zkoušené látky nevyplachují, s výjimkou pevných látek (viz část 1.4.2.3.2) a v případě okamžitých leptavých nebo dráždivých účinků. Použití satelitní skupiny pokusných zvířat k vyšetření vlivu výplachu očí se nedoporučuje, pokud to není vědecky odůvodněno. Je-li satelitní skupina nezbytná, použijí se dva králíci. Podmínky výplachu se podrobně zdokumentují, např. doba výplachu, složení a teplota promývacího roztoku, trvání, objem a rychlost aplikace.

1.4.2.3 Úroveň dávek

1.4.2.3.1 Zkoušení kapalin
Při zkoušení kapalin se použije dávka 0,1 ml. K instilaci látky přímo do oka by se neměly používat aerosolové rozstřikovače s čerpadlem. Před instilací 0,1 ml do oka by se měla tekutina z rozstřikovače vypudit a shromáždit do nádobky.

1.4.2.3.2 Zkoušení pevných látek
Při zkoušení pevných látek, past a zrnitých látek se použije objem 0,1 ml nebo hmotnost nejvýše 100 mg. Zkoušená látka se rozemele na jemný prášek. Objem pevného materiálu se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáním odměrnou nádobkou. Pokud se pevná zkoušená látka z oka pokusného zvířete neodstranila pomocí fyziologických mechanismů do doby prvního pozorování po 1 h po aplikaci, lze oko vypláchnout fyziologickým roztokem nebo destilovanou vodou.

1.4.2.3.3 Zkoušení aerosolů
Před instilací látek do oka se doporučuje zachytit látky obsažené v rozstřikovačích nebo aerosolech do nádobky. Jedinou výjimkou jsou látky obsažené v aerosolové nádobce pod tlakem, které z důvodu odpařování zachytit nelze. V takových případech se oko podrží otevřené a látka se do oka aplikuje vstříknutím trvajícím jednu sekundu ze vzdálenosti 10 cm přímo před okem. Vzdálenost se může podle tlaku v rozprašovači a jeho obsahu lišit. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození oka tlakem z rozprašovače. V příslušných případech může být nutné vyhodnotit potenciál „mechanického“ poškození oka v důsledku rozprašovacího tlaku.
Dávku aerosolu lze odhadnout na základě této simulované zkoušky: látka se nastříká na odvažovací papír skrz otvor o velikosti králičího oka, přičemž tento otvor se nachází bezprostředně před papírem. Na základě zvýšení hmotnosti papíru se odhadne množství látky, která se vstříkne do oka. U těkavých látek lze dávku odhadnout pomocí zvážení odběrové nádobky před odstraněním zkoušené látky a po jejím odstranění.

1.4.2.4 Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo na jednom pokusném zvířeti)
Jak je uvedeno ve strategii postupného zkoušení (viz tabulka 10), důrazně se doporučuje, aby byla zkouška in vivo provedena nejprve na jednom pokusném zvířeti.
Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že látka má leptavé nebo vysoce dráždivé účinky na oči při použití popsaného postupu, další zkoušení dráždivých účinků na oči se neprovede.

1.4.2.5 Lokální anestetika
V jednotlivých případech lze použít lokální anestetika. Pokud analýza průkaznosti výsledků naznačuje, že látka může způsobit bolest, nebo pokud počáteční zkoušky ukazují, že se objeví bolestivá reakce, lze před instilací zkoušené látky použít lokální anestetika. Typ, koncentraci a dávku lokálního anestetika je třeba pečlivě zvolit, aby bylo zajištěno, že v důsledku jeho použití nedojde k odlišným reakcím na zkoušenou látku. Podobně se musí znecitlivit i kontrolní oko.

1.4.2.6 Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na oči in vivo na dalších pokusných zvířatech)
Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na maximálně dalších dvou pokusných zvířatech. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován značný leptavý účinek, který naznačuje možný silný (nevratný) účinek v potvrzující zkoušce, doporučuje se provést potvrzující zkoušku metodou postupného zkoušení na jednom pokusném zvířeti spíše než exponováním dalších dvou pokusných zvířat současně. Pokud se u druhého pokusného zvířete projeví leptavé nebo vysoce dráždivé účinky, ve zkoušce se nepokračuje. K potvrzení slabých nebo mírných dráždivých reakcí může být nutné použít další pokusná zvířata.

1.4.2.7 Doba pozorování
Doba pozorování by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit míru a vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena kdykoliv v okamžiku, kdy pokusné zvíře vykazuje přetrvávající příznaky značné bolesti nebo utrpení^7a). Za účelem určení vratnosti účinků by se pokusná zvířata měla obvykle pozorovat 21 dnů po podání zkoušené látky. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 21 dnů, zkouška by se měla v tomto okamžiku ukončit.

1.4.2.7.1 Klinická pozorování a hodnocení očních reakcí
Oči se vyšetří po 1, 24, 48 a 72 h po podání zkoušené látky. Jakmile se získají konečné informace, nemělo by zkoušení na pokusných zvířatech probíhat déle, než je nezbytné. Pokusná zvířata se známkami přetrvávajících prudkých bolestí nebo utrpení se neprodleně humánně utratí a látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Humánně se utratí ta pokusná zvířata, u nichž došlo po instilaci k těmto očním lézím: perforace rohovky nebo výrazné zvředovatění rohovky včetně stafylomu; krev v přední komoře oční; zákal rohovky stupně 4 přetrvávající 48 h; absence reakce na osvit (reakce duhovky stupně 2) přetrvávající 72 h; zvředovatění spojivkové membrány; nekróza spojivek nebo slzné žlázy; nebo odlupování nekrotické hmoty. Tento postup je dán nevratností takových lézí.
Pokusná zvířata, u nichž oční léze nevzniknou, nelze utratit dříve než 3 dny po instilaci. Pokusná zvířata s mírnými až středními lézemi se pozorují, dokud léze nevymizí, nebo po 21 dnů, po jejichž uplynutí se studie ukončí. Po 7, 14 a 21 dnech se provádí pozorování, aby se určil stav lézí a jejich vratnost nebo nevratnost.
Stupeň reakce oka (spojivek, rohovky a duhovky) je třeba zaznamenat při každém vyšetření (tabulka 11). Uvedou se také jakékoli jiné oční léze (např. panus, zbarvení) nebo nežádoucí systémové účinky.
Vyšetřování reakcí lze usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 h mohou být oči pokusných zvířat dále vyšetřeny fluoresceinem.
Hodnocení očních reakcí je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení očních reakcí a napomáhat zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování.