3 MUTAGENITA - GENOTOXICITA
Mutagenita se vztahuje k indukci trvalých přenosných změn v množství nebo struktuře genetického materiálu buněk nebo organismů. Tyto změny („mutace“) mohou postihnout jediný gen nebo segmenty genů, blok genů nebo celé chromozómy. Účinky na celé chromozómy se mohou projevovat změnou jejich struktury a/nebo počtu.
Mutagenní aktivita látky se stanoví testy in vitro na genové (bodové) mutace v baktériích (metoda B.13/14)⁵) anebo na strukturální chromozómové aberace v savčích buňkách (metoda B.10)⁵).
Přijatelné jsou také postupy in vivo, např. micronucleus test (metoda B.12)⁵) nebo analýza metafáze chromozomů kostní dřeně (metoda B.11)⁵). Je však třeba dávat jednoznačně přednost in vitro metodám, pokud nejsou kontraindikovány.
Pro látky vyráběné ve velkém množství nebo pro stanovení a kontrolu rizika mohou být vyžadovány ještě další studie ke zjištění mutagenity nebo k předběžnému vyšetření na karcinogenitu. Tyto studie lze využít k několika účelům: potvrzení výsledků získaných základním souborem testů; zkoumání účinků nezachycených základním souborem metod; zahájení nebo rozšíření studií in vivo.
Pro tyto účely zahrnují metody B.15,¹) B.16,¹) B.17,⁵) B.18,¹) B.19,¹) B.20,¹) B.21,¹) B.22,¹) B.23,⁵) B.24¹) a B.25¹) jak eukaryontní systémy in vivo a in vitro, tak rozšiřují rozsah biologických účinků. Tyto testy poskytují informace o bodových mutacích a jiných účincích v organismech složitějších než baktérie používané v základním souboru testů.
Obecně platí, že další uvažované studie mutagenity je třeba naplánovat tak, aby poskytly relevantní doplňující informace o mutagenním, případně karcinogenním potenciálu testované látky.
Konkrétní studie, vhodná pro daný případ, bude záviset na četných faktorech, včetně chemické a fyzikální charakteristiky látky, výsledků základních bakteriálních a cytogenetických testů, metabolického profilu látky, výsledků dalších testů toxicity a známých způsobů použití látky.
Některé všeobecné zásady pro strategii testování jsou stanoveny směrnicí 93/67/EHS.
Metody pro další výzkum jsou seřazeny níže podle jimi sledovaného hlavního genetického účinku:
Studie detekující genové (bodové) mutace
Studie detekující chromozómové aberace
Genotoxické účinky – účinky na DNA
Genotoxicita je obecný pojem pro potenciálně škodlivé účinky na genetický materiál, které nejsou nezbytně spojeny s mutagenitou. Indikátorem genotoxicity může být vyvolané poškození DNA bez přímého důkazu mutace.
Následující metody využívající eukaryotické mikroorganismy nebo savčí buňky jsou vhodné pro takové studie:
Alternativní metody vyšetřování karcinogenního potenciálu
K dispozici jsou testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).¹) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.
Posuzování rizika dědičných účinků u savců
K dispozici jsou metody na detekci dědičných účinků v celém savčím organizmu, ať už vyvolaných genovými (bodovými) mutacemi, např. specifický locus test u myší detekující mutace zárodečné buňky v první generaci (nezahrnuto v této příloze), nebo chromozómovými aberacemi, např. test na přenosné translokace u myší (metoda B.25).¹) Těchto metod lze použít při odhadování možného genetického rizika látky pro člověka. Vzhledem ke složitosti těchto testů a velkému počtu potřebných zvířat, zvláště pro specifický locus test, je třeba se rozhodovat pro takovou studii jen na základě závažných důvodů.
Při stanovení genotoxicity se postupuje podle standardního metodického protokolu vypracovaného pro danou metodiku po projednání s Národní referenční laboratoří genetické toxikologie.

a) Cytogenetický test na savcích in vivo. Provedení in vivo analýzy metafáze chromózomů buněk kostní dřeně by mělo být zváženo, pokud nebylo zahrnuto do základního vyšetření (metoda B.11).⁵) Další možnost je cytogenetická analýza zárodečných buněk in vivo (metoda B.23).⁵)

a) Mitotická rekombinace u Saccharomyces cerevisiae (metoda B.16).¹)

a) Studie forward nebo reversních mutací s využitím eukaryotických mikroorganismů (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B.15).¹)

b) Cytogenetický test na savčích buňkách in vitro, pokud nebyl zařazen do základního vyšetření (B.10).⁵)

b) Poškození DNA reparace – neplánovaná syntéza DNA v savčích buňkách – in vitro (metoda B.18).¹)

b) In vitro test forward mutací v savčích buňkách (metoda B.17).⁵)

c) Dominantní letální test na hlodavcích (metoda B.22).¹)

c) Výměna sesterských chromatid v savčích buňkách – in vitro (metoda B.19).¹)

c) Test na pohlaví vázané recesivní letální mutace u Drosophila melanogaster (metoda B.20).¹)

d) Test na dědičnou translokaci u myší (metoda B.25).¹)

d) In vivo test mutací na somatických buňkách, spot test na myších (metoda B.24).¹)