19. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HEXACHLOROFENU (INN)
A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda je vhodná pro všechny kosmetické prostředky.
2. PRINCIP
Hexachlorofen ve vzorku se extrahuje ethylacetátem a kvalitativně se stanoví chromatografií na tenké vrstvě.
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
3.1 Kyselina sírová, 4 mol/l
3.2 Celit AW
3.3 Ethylacetát
3.4 Mobilní fáze: Benzen obsahující 1 % (V/V) ledové kyseliny octové.
3.5 Detekční činidlo I:
Roztok rhodaminu B: Rozpustí se 100 mg rhodaminu B ve směsi 150 ml diethyletheru, 70 ml absolutního ethanolu a 16 ml vody.
3.6 Detekční činidlo II:
Roztok 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu: 400 mg 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu se rozpustí ve 100 ml methanolu (připravuje se čerstvý každý den).
Roztok uhličitanu sodného: 10 g uhličitanu sodného se rozpustí ve 100 ml demineralizované vody.
3.7 Standardní roztok:
Hexachlorofen, 0,05% roztok (m/V) v ethylacetátu
4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
4.1 TLC desky Kieselgel 254, 200 x 200 mm (nebo ekvivalentní)
4.2 Obvyklé vybavení pro TLC
4.3 Lázeň pro temperaci chromatografické komory udržovaná na teplotě 26 °C
5. PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍHO VZORKU
5.1 1 g homogenizovaného vzorku se důkladně promíchá s 1 g Celitu AW (3.2) a 1 ml kyseliny sírové (3.1).
5.2 Suší se 2 hodiny při 100 °C.
5.3 Nechá se vychladnout a vysušený zbytek se rozdrtí na jemný prášek.
5.4 Dvakrát se extrahuje vždy 10 ml ethylacetátu (3.3), po každé extrakci se odstředí a ethylacetátové vrstvy se sloučí.
5.5 Odpaří se při 60 °C.
5.6 Odparek se rozpustí ve 2 ml ethylacetátu (3.3).
6. POSTUP
6.1 2 μl roztoku zkušebního vzorku (5.6) a 2 μl standardního roztoku (3.7) se nanesou na desku pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1).
6.2 Komora (4.3) se nasytí mobilní fází (3.4).
6.3 Deska pro chromatografii na tenké vrstvě se vloží do komory a vyvíjí se do vzdálenosti čela 150 mm.
6.4 Deska pro chromatografii na tenké vrstvě se vyjme z komory a suší se v sušárně s nuceným oběhem vzduchu při teplotě asi 105 °C.
6.5 Detekce
Skvrny hexachlorofenu na desce pro chromatografii na tenké vrstvě se detekují způsobem popsaným v bodě 6.5.1 nebo 6.5.2.
6.5.1 Deska se rovnoměrně postříká detekčním činidlem I (3.5). Po 30 minutách se deska pozoruje v UV světle při 254 nm.
6.5.2 Deska se rovnoměrně postříká roztokem 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu detekčního činidla II (3.6). Následně se deska postříká roztokem uhličitanu sodného (3.6). Deska se po 10 minutách sušení při pokojové teplotě pozoruje v denním světle.
7. INTERPRETACE
7.1 Detekční činidlo I (3.5):
Hexachlorofen se detekuje jako namodralá skvrna na žluto-oranžovém fluoreskujícím pozadí a má Rf přibližně 0,5.
7.2 Detekční činidlo II (3.6):
Hexachlorofen se detekuje jako blankytně modrá až tyrkysově zbarvená skvrna na bílém pozadí a má Rf přibližně 0,5.
B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda je vhodná pro všechny kosmetické prostředky.
2. DEFINICE
Obsah hexachlorofenu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech hexachlorofenu.
3. PRINCIP
Hexachlorofen se stanovuje po přeměně na methylderivát plynovou chromatografií s detektorem elektronového záchytu.
4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
4.1 Ethylacetát
4.2 N-methyl-N-nitroso-p-toluensulfonamid (diazald)
4.3 Diethylether
4.4 Methanol
4.5 2-(2-ethoxyethoxy)ethanol (karbitol)
4.6 Kyselina mravenčí
4.7 Hydroxid draselný, 50% vodný roztok (m/m) (připravuje se vždy čerstvý)
4.8 Hexan pro spektroskopii
4.9 Bromchlorofen (standard č. 1)
4.10 4,4',6,6'-tetrachlor-2,2'-thiodifenol (standard č. 2)
4.11 2,4,4'-trichlor-2-hydroxydifenylether (standard č. 3)
4.12 Aceton
4.13 Kyselina sírová, 4M
4.14 Celit AW
4.15 Kyselina mravenčí v ethylacetátu, 10% roztok (V/V)
4.16 Hexachlorofen
5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
5.1 Obvyklé laboratorní sklo
5.2 Miniaparatura pro přípravu diazomethanu (Analyt. Chem. 1973, 45, 2302-2)
5.3 Plynový chromatograf vybavený detektorem elektronového záchytu se zdrojem 63Ni
6. POSTUP
6.1 Příprava standardního roztoku
Standard se zvolí tak, aby neinterferoval se žádnou látkou obsaženou v analyzovaném výrobku jako pomocná látka. Obvykle je nejvhodnější standard č. 1 (4.9).
6.1.1 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 50 mg standardu č. 1, 2 nebo 3 přesně (4.9, 4.10 nebo 4.11) a 50 mg hexachlorofenu (4.16). Doplní se na objem ethylacetátem (4.1) (roztok A). 10 ml roztoku A se zředí ethylacetátem (4.1) na 100 ml (roztok B).
6.1.2 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 50 mg standardu č. 1, 2 nebo 3 přesně (4.9, 4.10 nebo 4.11). Doplní se na objem ethylacetátem (4.1) (roztok C).
6.2 Příprava vzorku
Naváží se asi 1 g homogenizovaného vzorku přesně a důkladně se promíchá s 1 ml kyseliny sírové (4.13), 15 ml acetonu (4.12) a 8 g Celitu AW (4.14). Směs se 30 minut suší vzduchem na vodní lázni, poté se jeden a půl hodiny suší v sušárně s nuceným oběhem vzduchu. Nechá se vychladnout, zbytek se rozdrtí na jemný prášek a převede do skleněné kolony. Eluuje se ethylacetátem (4.1) a jímá se 100 ml. Přidají se 2 ml roztoku vnitřního standardu (roztok C) (6.1.2).
(Vzhledem k tomu, že hexachlorofen je obsažen v celé řadě typů výrobků, je důležité před definitivním zaznamenáním výsledků stanovit výtěžek hexachlorofenu při stanovení v dotyčném vzorku tímto postupem. Jsou-li výtěžky nízké, mohou být se souhlasem zúčastněných stran provedeny změny, například změna rozpouštědla (benzen místo ethylacetátu) apod.)
6.3 Methylace vzorku
Všechna reakční činidla a aparatura se 2 hodiny chladí na teplotu 0 až 4 °C. Do vnějšího zásobníku diazomethanové aparatury se převede 1,2 ml roztoku připraveného podle bodu 6.2 a 0,1 ml methanolu (4.4). Do středního zásobníku se převede asi 200 mg diazaldu (4.2), přidá se 1 ml karbitolu (4.5) a 1 ml diethyletheru (4.3) a nechá se rozpustit. Aparatura se sestaví, z poloviny se ponoří do lázně o teplotě 0 °C a do středního zásobníku se injekční stříkačkou zavede asi 1 ml vychlazeného roztoku hydroxidu draselného (4.7). Je třeba se přesvědčit, že žluté zbarvení způsobené vzniklým diazomethanem přetrvává. Pokud žluté zbarvení nepřetrvává, methylace se opakuje s dalšími 200 mg diazaldu (4.2).
(Přetrvávání tohoto žlutého zbarvení je známkou přebytku diazomethanu, který je nezbytný pro zajištění úplné methylace vzorku.)
Aparatura se po 15 minutách vyjme z lázně a ponechá se uzavřená při laboratorní teplotě 12 hodin. Aparatura se otevře, přebytek diazomethanu se odstraní přídavkem několika kapek 10% (V/V) roztoku kyseliny mravenčí v ethylacetátu (4.15), organický roztok se převede do odměrné baňky na 25 ml. Doplní se na objem hexanem (4.8).
1,5 μl tohoto roztoku se nastříkne do chromatografu.
6.4 Methylace standardu
Všechna reakční činidla a aparatura se 2 hodiny chladí na teplotu 0 až 4 °C. Do vnějšího zásobníku diazomethanové aparatury se umístí:
0,2 ml roztoku B (6.1.1),
1 ml ethylacetátu (4.1),
0,1 ml methanolu (4.4).
V methylaci se pokračuje tak, jak je popsáno v bodě 6.3. 1,5 μl výsledného roztoku se nastříkne do chromatografu.
7. PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE
Kolona musí zaručit rozlišení „R“ rovné nebo lepší než 1,5, kde:
kde
| r1 a r2 = | retenční časy dvou píků (v min.), |
| W1 a W2 = | šířky píků v polovině výšky píků (v mm), |
| d' = | rychlost posuvu papíru (v mm/min.). |
Jako vhodné se ukázaly následující chromatografické podmínky:
Kolona: nerezová ocel.
Délka: 1,7 m.
Průměr: 3 mm.
Nosič:
Chromosorb WAW
zrnitost: 80 až 100 mesh.
Stacionární fáze: 10% OV 17.
Teploty:
kolona: 280 °C,
nástřik: 280 °C,
detektor: 280 °C.
Nosný plyn: dusík zbavený kyslíku.
Tlak: 2,3 bar.
Průtok: 30 ml/min.
8. VÝPOČET
8.1 Koeficient úměrnosti hexachlorofenu
Bude odpovídat zvolenému standardu a jeho poměru ve standardní směsi.
Označí-li se
h = hexachlorofen,
kh = jeho koeficient úměrnosti,
m'h = jeho hmotnost ve směsi (v g),
A'h = plocha jeho píku,
s = vybraný standard,
m's = jeho hmotnost ve směsi (v g),
A's = plocha jeho píku,
potom:
8.2 Množství hexachlorofenu ve vzorku
Označí-li se
h = hexachlorofen,
kh = jeho koeficient úměrnosti,
Ah = plocha jeho píku,
s = vybraný standard,
ms = jeho hmotnost ve směsi (v g),
As = plocha jeho píku,
M = hmotnost odebraného vzorku (v g),
potom % (m/m) hexachlorofenu ve vzorku je
8. OPAKOVATELNOST
Pro výrobky obsahující asi 0,1 % (m/m) hexachlorofenu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.