A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda slouží ke kvalitativnímu stanovení 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu (glycerol-1-(4-aminobenzoátu)). Slouží rovněž ke kvalitativnímu stanovení ethyl-4-aminobenzoátu (benzokainu INN), který může být přítomen jako nečistota.

2. PRINCIP
Kvalitativní stanovení se provádí chromatografií na tenké vrstvě
s použitím silikagelu a fluorescentního indikátoru a důkazem volné primární aminoskupiny prostřednictvím tvorby diazobarviva na desce.

3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

3.1 Směs rozpouštědel: cyklohexan/propan-2-ol/stabilizovaný dichlormethan 48/64/9 (V/V/V).

3.2 Mobilní fáze: petrolether (40-60)/benzen/aceton/roztok hydroxidu amonného (alespoň 25 % amoniaku): 35/35/35/1 (V/V/V/V).

3.3 Detekční činidlo: a) dusitan sodný: 1 g ve 100 ml 1M HCl (připravený těsně před použitím),

b) 2-naftol: 0,2 g ve 100 ml 1M hydroxidu draselného.

3.4 Standardní roztoky:
2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát: 0,05 g ve 100 ml směsného rozpouštědla 3.1;
ethyl-4-aminobenzoát: 0,05 g ve 100 ml směsného rozpouštědla 3.1.

3.5 Silikagelové desky 60 F254, o tloušťce vrstvy 0,25 mm, 200 mm x 200 mm.

4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1 Obvyklé zařízení pro chromatografii na tenké vrstvě

4.2 Ultrazvuková lázeň

4.3 Filtr Millipore FH 0,5 μm nebo ekvivalentní

5. POSTUP

5.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky s uzávěrem na 10 ml se naváží 1,5 g prostředku, který má být analyzován. Doplní se po rysku rozpouštědlem 3.1. Uzavře se a 1 hodinu ponechá při laboratorní teplotě v ultrazvukové lázni (4.2.). Zfiltruje se přes filtr Millipore (4.3) a filtrát se použije pro chromatografii.

5.2 Chromatografie na tenké vrstvě
Na desku (3.5) se nanese 10 μl roztoku vzorku (5.1) a každého ze standardních roztoků (3.4). Chromatogram se vyvíjí do výšky 150 mm v komoře předem nasycené mobilní fází 3.2. Deska se nechá vyschnout při teplotě okolí.

5.3 Detekce

5.3.1 Deska se pozoruje pod UV světlem 254 nm.

5.3.2 Zcela vysušená deska se postříká detekčním roztokem 3.3 a).
Deska se nechá schnout 1 minutu při laboratorní teplotě a ihned se postříká detekčním roztokem 3.3 b). Vysuší se v sušárně při 60 °C. Objeví se skvrny oranžové barvy. 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát: Rf asi 0,07, ethyl-4-aminobenzoát: Rf 0,55.