bod 24 · 494/2005 Sb.

24. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ 2,3-DIHYDROXYPROPYL-4-AMINOBENZOÁTU

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda slouží ke kvalitativnímu stanovení 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu (glycerol-1-(4-aminobenzoátu)). Slouží rovněž ke kvalitativnímu stanovení ethyl-4-aminobenzoátu (benzokainu INN), který může být přítomen jako nečistota.

2. PRINCIP
Kvalitativní stanovení se provádí chromatografií na tenké vrstvě
s použitím silikagelu a fluorescentního indikátoru a důkazem volné primární aminoskupiny prostřednictvím tvorby diazobarviva na desce.

3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

3.1 Směs rozpouštědel: cyklohexan/propan-2-ol/stabilizovaný dichlormethan 48/64/9 (V/V/V).

3.2 Mobilní fáze: petrolether (40-60)/benzen/aceton/roztok hydroxidu amonného (alespoň 25 % amoniaku): 35/35/35/1 (V/V/V/V).

3.3 Detekční činidlo: a) dusitan sodný: 1 g ve 100 ml 1M HCl (připravený těsně před použitím),

b) 2-naftol: 0,2 g ve 100 ml 1M hydroxidu draselného.

3.4 Standardní roztoky:
2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát: 0,05 g ve 100 ml směsného rozpouštědla 3.1;
ethyl-4-aminobenzoát: 0,05 g ve 100 ml směsného rozpouštědla 3.1.

3.5 Silikagelové desky 60 F254, o tloušťce vrstvy 0,25 mm, 200 mm x 200 mm.

4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1 Obvyklé zařízení pro chromatografii na tenké vrstvě

4.2 Ultrazvuková lázeň

4.3 Filtr Millipore FH 0,5 μm nebo ekvivalentní

5. POSTUP

5.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky s uzávěrem na 10 ml se naváží 1,5 g prostředku, který má být analyzován. Doplní se po rysku rozpouštědlem 3.1. Uzavře se a 1 hodinu ponechá při laboratorní teplotě v ultrazvukové lázni (4.2.). Zfiltruje se přes filtr Millipore (4.3) a filtrát se použije pro chromatografii.

5.2 Chromatografie na tenké vrstvě
Na desku (3.5) se nanese 10 μl roztoku vzorku (5.1) a každého ze standardních roztoků (3.4). Chromatogram se vyvíjí do výšky 150 mm v komoře předem nasycené mobilní fází 3.2. Deska se nechá vyschnout při teplotě okolí.

5.3 Detekce

5.3.1 Deska se pozoruje pod UV světlem 254 nm.

5.3.2 Zcela vysušená deska se postříká detekčním roztokem 3.3 a).
Deska se nechá schnout 1 minutu při laboratorní teplotě a ihned se postříká detekčním roztokem 3.3 b). Vysuší se v sušárně při 60 °C. Objeví se skvrny oranžové barvy. 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát: R_f asi 0,07, ethyl-4-aminobenzoát: R_f 0,55.

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda slouží ke kvantitativnímu stanovení 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu rovněž stanovuje ethyl-4-aminobenzoát. Nelze stanovit více než 5 % (m/m) 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu a více než 1 % (m/m) ethyl-4-aminobenzoátu.

2. DEFINICE
Obsah 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu a obsah ethyl-4-aminobenzoátu stanovené touto metodou se vyjádří v procentech (% m/m) hmotnosti prostředku.

3. PRINCIP
Prostředek, který má být analyzován, se suspenduje v methanolu a po vhodné úpravě vzorku se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC.

4.1 Methanol

4.2 Dihydrogenfosforečnan draselný (KH₂PO₄)

4.3 Octan zinečnatý (Zn(CH₃COO)₂·2H₂O)

4.4 Kyselina octová $(d_{4}^{20} = 1, 05)$

4.5 Hexakyanoželeznatan draselný (K₄(Fe(CN)₆)·3H₂O)

4.6 Ethyl-4-hydroxybenzoát

4.7 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát

4.8 Ethyl-4-aminobenzoát

4.9 Fosfátový tlumivý roztok (0,02M): rozpustí se 2,72 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4.2) v 1 litru vody.

4.10 Mobilní fáze: fosfátový tlumivý roztok (4.9)/methanol (4.1) 61/39 (V/V)
Složení mobilní fáze může být změněno s cílem dosáhnout faktoru rozlišení R ≥1,5.
$R = 2 \frac{d' R_{2} - d' R_{1}}{W_{1} + W_{2}}$
kde

R₁ a R₂=	retenční časy píků v min.,
W₁ a W₂ =	šířky píků v polovině výšky píků v mm,
d' =	rychlost posuvu papíru v mm/min..

4.11 Zásobní roztok 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu: Naváží se asi 40 mg 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.

4.12 Zásobní roztok ethyl-4-aminobenzoátu: Naváží se asi 40 mg ethyl-4-aminobenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.

4.13 Roztok vnitřního standardu: Naváží se asi 50 mg ethyl-4-hydroxybenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.

4.14 Standardní roztoky: Připraví se čtyři standardní roztoky rozpuštěním následujících látek ve 100 ml mobilní fáze (4.10) podle následující tabulky:

Standardní roztok	2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát		ethyl-4-aminobenzoát		ethyl-4-hydroxybenzoát
	(μg/ml) (*)	ml (4.11)	(μg/ml) (*)	ml (4.12)	(μg/ml) (*)	ml (4.13)
I	8	2	8	2	50	10
II	16	4	12	3	50	10
III	24	6	16	4	50	10
IV	40	10	20	5	50	10
(*) Tyto hodnoty jsou informativní a odpovídají přesným hmotnostem v 4.11, 4.12 a 4.13.
Poznámka: Tyto roztoky mohou být připraveny jiným způsobem.

4.15 Carrezovo činidlo I: Rozpustí se 26,5 g hexakyanoželeznatanu draselného (4.5) ve vodě a doplní se do 250 ml.

4.16 Carrezovo činidlo II: Rozpustí se 54,9 g octanu zinečnatého (4.3) a 7,5 ml kyseliny octové (4.4) ve vodě a doplní se do 250 ml.

4.17 Merck Lichrosorb RP-18, nebo ekvivalentní, s průměrnou velikostí částic 5 μm

5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

5.2 Zařízení pro vysokoúčinnou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnové délce a komorou s termostatem nastaveným na 45 °C

5.3 Kolona z nerezové oceli: délka: 250 mm; vnitřní průměr: 4,6 mm; náplň Lichrosorb RP-18 (4.17)

5.4 Ultrazvuková lázeň

6. POSTUP

6.1 Příprava vzorku

6.1.1 Do kádinky na 100 ml se přesně naváží 1 g vzorku a přidá se 10 ml methanolu (4.1).

6.1.2 Kádinka se na 20 minut umístí do ultrazvukové lázně (5.4), aby se vytvořila suspenze. Takto vytvořená suspenze se kvantitativně převede nejvýše 75 ml mobilní fáze (4.10) do odměrné baňky na 100 ml.
Postupně se přidá 1 ml Carrezova činidla I (4.15) a 1 ml Carrezova činidla II (4.16) a po každém přidání se promíchá. Doplní se elučním roztokem (4.10) po rysku, znovu se promíchá a zfiltruje se přes skládaný filtrační papír.

6.1.3 Do odměrné baňky na 50 ml se pipetou převede 3,0 ml filtrátu získaného podle bodu 6.1.2 a 5,0 ml roztoku vnitřního standardu (4.13). Doplní se mobilní fází po rysku a promíchá se. Takto získaný roztok se použije pro provedení chromatografické analýzy popsané v bodě 6.2.

6.2 Chromatografie

6.2.1 Průtok mobilní fáze (4.10) se upraví na 1,2 ml/min a teplota kolony se nastaví na 45 °C.

6.2.2 Detektor (5.2) se nastaví na 274 nm.

6.2.3 Do chromatografu se mikrostříkačkou alespoň dvakrát nastříkne 20 μl roztoku (6.1.3) a změří se plochy píků.

6.3 Kalibrační křivka

6.3.1 Nastříkne se 20 μl každého ze standardních roztoků (4.14) a změří se plochy píků.

6.3.2 Pro každou koncentraci se vypočte poměr ploch píků 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu k plochám píků vnitřního standardu. Tento poměr se vynese na osu x a na osu y se vynese poměr odpovídajících hmotností.

6.3.3 Stejným způsobem se postupuje v případě ethyl-4-hydroxybenzoátu.

7. VÝPOČET

7.1 Z kalibrační křivky získané v bodě 6.3 se odečtou poměry hmotností (RP1, RP2) odpovídající poměrům mezi plochami píků vypočítanými v bodě 6.2.3, kde

RP1 =	hmotnost 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu /hmotnost ethyl-4-hydroxybenzoátu,
RP2 =	hmotnost ethyl-4-aminobenzoátu/hmotnost ethyl-4-hydroxybenzoátu,

7.2 Z takto získaných poměrů hmotností se vypočítá obsah 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu a obsah ethyl-4-aminobenzoátu v hmotnostních procentech (% m/m) pomocí vzorce:
$R_{p} % (m / m) 2, 3 - dihydroxypropyl - 4 - aminobenzoátu = RP 1 \times \frac{q}{6 p}$
$R_{p} % (m / m) ethyl - 4 - aminobenzoátu = RP 2 \times \frac{q}{6 p}$

q =	množství ethyl-4-hydroxybenzoátu (vnitřního standardu) navážené v bodě 4.12 v mg,
p =	množství vzorku navážené v bodě 6.1.1 v g.

8. OPAKOVATELNOST

8.1 Pro výrobky obsahující asi 5 % (m/m) 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,25 %.

8.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) ethyl-4-aminobenzoátu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.

9. POZNÁMKY

9.1 Před provedením analýzy je třeba zkontrolovat, zda vzorek neobsahuje látky, jejichž píky by mohly interferovat s vnitřním standardem (ethyl-4-aminobenzoát).

9.2 Pro kontrolu, zda nedochází k další interferenci, se stanovení opakuje, přičemž se podíl methanolu v mobilní fázi změní relativně o 10 %.