B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení chininu. Metodu lze použít ke stanovení chininu do nejvyšší přípustné koncentrace 0,5 % (m/m) v šamponech a 0,2 % ve vlasových lotionech.

4.1 Acetonitril

4.2 Dihydrogenfosforečnan draselný (KH₂PO₄)

4.3 Kyselina trihydrogenfosforečná (85 %;$d_4^{20}=1,7)$

4.4 Tetramethylamoniumbromid

4.5 Chinin bezvodý

4.6 Methanol

4.7 Roztok kyseliny trihydrogenfosforečné (0,1M): Naváží se 11,53 g kyseliny trihydrogenfosforečné (4.3) a rozpustí se v odměrné baňce v 1000 ml vody.

4.8 Roztok dihydrogenfosforečnanu draselného (0,1M): Naváží se 13,6 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4.2) a rozpustí se v odměrné baňce v 1000 ml vody.

4.9 Roztok tetramethylamoniumbromidu: Rozpustí se 15,40 g tetramethylamoniumbromidu (4.4) v odměrné baňce v 1000 ml vody.

4.10 Mobilní fáze: Kyselina trihydrogenfosforečná (4.7)/roztok dihydrogenfosforečnanu draselného (4.8)/roztok tetramethylamonium bromidu (4.9)/voda/acetonitril (4.1) 10/50/100/340/90 (V/V/V/V/V).
Složení uvedené mobilní fáze může být změněno tak, aby se dosáhlo rozlišení R ≥1,5.
$R=2\frac{d´R_2-d´R_1}{W_1+W_2}$
kde

R1 a R2 =	retenční časy píků v min.,
W1 a W2 =	šířky píků v polovině výšky píků v mm,
d' =	rychlost posuvu papíru v mm/min.

4.11 Silikagel oktadecylsilylovaný, 10 μm

4.12 Standardní roztoky: Do odměrných baněk na 100 ml se naváží asi 5,0; 10,0; 15,0 a 20,0 mg bezvodého chininu přesně (4.5), doplní se po rysku methanolem (4.6) a obsah se protřepe, dokud se chinin nerozpustí. Roztoky se filtrují přes filtr 0,5 μm.

2. DEFINICE
Obsah chininu stanovený touto metodou se vyjádří v procentech hmotnosti (% m/m) prostředku.

3. PRINCIP
Po vhodném zpracování prostředku, který má být analyzován, se stanovení provede vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC.

5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

5.2 Ultrazvuková lázeň

5.3 Zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou

5.4 Kolona: délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, náplň: silikagel (4.11)

5.5 Filtr Millipore FH 0,5 μm nebo ekvivalentní s vhodným filtračním zařízením

6. POSTUP

6.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží množství prostředku, které obsahuje asi 10,0 mg bezvodého chininu, přidá se 20 ml methanolu (4.6) a láhev se ponoří na 20 minut do ultrazvukové lázně (5.2). Objem se doplní po rysku methanolem (4.6), promíchá se a alikvotní podíl se zfiltruje (5.5).

6.2 Chromatografické podmínky
Průtok: 1,0 ml/min.
Vlnová délka detektoru (5.3): 332 nm.
Objem nástřiku: 10 μl filtrovaného roztoku (6.1).
Měřená veličina: plocha píku.

6.3 Kalibrační křivka
Alespoň třikrát se nastříkne 10 μl každého standardního roztoku (4.12), změří se plocha píků a vypočte se průměrná hodnota pro každou koncentraci.
Sestrojí se kalibrační křivka a ověří se, zda tvoří přímku.

7. VÝPOČET

7.1 Z kalibrační křivky (6.3) se odečte množství bezvodého chininu v μg, obsaženého v nastříknutém objemu (6.2).

7.2 Koncentrace bezvodého chininu ve vzorku vyjádřená v hmotnostních procentech (% m/m) se vypočte ze vzorce:
$\%(m/m)\mathrm{bezvodého}\mathrm{chininu}=\frac{B}{A}$
kde

B =	množství bezvodého chininu v μg nalezené v 10 mikrolitrech zfiltrovaného roztoku (6.1),
A =	hmotnost vzorku v g (6.1).

8. OPAKOVATELNOST
Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) bezvodého chininu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,02 %.
Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) bezvodého chininu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,01 %.