26. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ CHININU

A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda je určená ke kvalitativnímu stanovení přítomnosti chininu v šamponech a vlasových lotionech.

2. PRINCIP
Kvalitativní stanovení se provádí chromatografií na tenké vrstvě silikagelu. Důkazem chininu je modrá fluorescence v kyselém prostředí při 360 nm.
Pro další potvrzení lze fluorescenci odstranit parami bromu a páry čpavku vyvolají žlutou fluorescenci.

3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

3.1 Silikagelové desky bez fluorescenčního indikátoru, o tloušťce vrstvy 0,25 mm, 200 mm x 200 mm

3.2 Mobilní fáze: toluen/diethylether/dichlormethan/diethylamin 20/20/20/8 (V/V/V/V)

3.3 Methanol

3.4 Kyselina sírová (96%;$d_4^{20}=1,84)$

3.5 Diethylether

3.6 Detekční činidlo: k 95 ml diethyletheru (3.5) se v chlazené nádobě opatrně přidá 5 ml kyseliny sírové (3.4).

3.7 Brom

3.8 Vodný roztok amoniaku (28 %;$d_4^{20}=0,90)$

3.9 Chinin bezvodý

3.10 Standardní roztok: do odměrné baňky se naváží přesně asi 100,0 mg bezvodého chininu (3.9) a rozpustí se ve 100 ml methanolu (3.3).

4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě

4.2 Ultrazvuková lázeň

4.3 Filtr Millipore FH 0,5 μm nebo ekvivalentní a vhodné filtrační zařízení

5. POSTUP

5.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží množství vzorku, které obsahuje asi 100 mg chininu, rozpustí se a doplní po rysku methanolem (3.3).
Baňka se uzavře a ponechá jednu hodinu při laboratorní teplotě v ultrazvukové lázni (4.2). Obsah se zfiltruje (4.3) a filtrát se použije pro chromatografii.

5.2 Chromatografie na tenké vrstvě
Na desku (3.1) se nanese 1,0 μl standardního roztoku (3.10) a 1,0 μl roztoku vzorku (5.1). Chromatogram se vyvíjí do výšky 150 mm v komoře předem nasycené rozpouštědlem (3.2).

5.3 Detekce

5.3.1 Deska se vysuší při pokojové teplotě.

5.3.2 Postříká se činidlem 3.6.

5.3.3 Deska se nechá jednu hodinu schnout při laboratorní teplotě.

5.3.4 Pozoruje se ve světle UV lampy nastavené na vlnovou délku 360 nm. Chinin se projeví jako intenzivně fluoreskující modrá skvrna.
Jako příklad jsou v následující tabulce uvedeny hodnoty R_f hlavních chininových alkaloidů při vyvíjení chromatogramu rozpouštědlem 3.2:

Alkaloid	Rf
Chinin	0,20
Chinidin	0,29
Cinchonin	0,33
Cinchonidin	0,27
Hydrochinidin	0,17

5.3.5 Pro další potvrzení přítomnosti chininu se deska vystaví asi na jednu hodinu parám bromu (3.7). Fluorescence zmizí. Je-li tatáž deska vystavena parám amoniaku (3.8), skvrny se znovu objeví v hnědé barvě a pod světlem UV lampy (360 nm) je pozorovatelná nažloutlá fluorescence. Mez detekce: 0,1 μg chininu.

B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení chininu. Metodu lze použít ke stanovení chininu do nejvyšší přípustné koncentrace 0,5 % (m/m) v šamponech a 0,2 % ve vlasových lotionech.

4.1 Acetonitril

4.2 Dihydrogenfosforečnan draselný (KH₂PO₄)

4.3 Kyselina trihydrogenfosforečná (85 %;$d_4^{20}=1,7)$

4.4 Tetramethylamoniumbromid

4.5 Chinin bezvodý

4.6 Methanol

4.7 Roztok kyseliny trihydrogenfosforečné (0,1M): Naváží se 11,53 g kyseliny trihydrogenfosforečné (4.3) a rozpustí se v odměrné baňce v 1000 ml vody.

4.8 Roztok dihydrogenfosforečnanu draselného (0,1M): Naváží se 13,6 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4.2) a rozpustí se v odměrné baňce v 1000 ml vody.

4.9 Roztok tetramethylamoniumbromidu: Rozpustí se 15,40 g tetramethylamoniumbromidu (4.4) v odměrné baňce v 1000 ml vody.

4.10 Mobilní fáze: Kyselina trihydrogenfosforečná (4.7)/roztok dihydrogenfosforečnanu draselného (4.8)/roztok tetramethylamonium bromidu (4.9)/voda/acetonitril (4.1) 10/50/100/340/90 (V/V/V/V/V).
Složení uvedené mobilní fáze může být změněno tak, aby se dosáhlo rozlišení R ≥1,5.
$R=2\frac{d´R_2-d´R_1}{W_1+W_2}$
kde

R1 a R2 =	retenční časy píků v min.,
W1 a W2 =	šířky píků v polovině výšky píků v mm,
d' =	rychlost posuvu papíru v mm/min.

4.11 Silikagel oktadecylsilylovaný, 10 μm

4.12 Standardní roztoky: Do odměrných baněk na 100 ml se naváží asi 5,0; 10,0; 15,0 a 20,0 mg bezvodého chininu přesně (4.5), doplní se po rysku methanolem (4.6) a obsah se protřepe, dokud se chinin nerozpustí. Roztoky se filtrují přes filtr 0,5 μm.

2. DEFINICE
Obsah chininu stanovený touto metodou se vyjádří v procentech hmotnosti (% m/m) prostředku.

3. PRINCIP
Po vhodném zpracování prostředku, který má být analyzován, se stanovení provede vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC.

5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

5.2 Ultrazvuková lázeň

5.3 Zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou

5.4 Kolona: délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, náplň: silikagel (4.11)

5.5 Filtr Millipore FH 0,5 μm nebo ekvivalentní s vhodným filtračním zařízením

6. POSTUP

6.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží množství prostředku, které obsahuje asi 10,0 mg bezvodého chininu, přidá se 20 ml methanolu (4.6) a láhev se ponoří na 20 minut do ultrazvukové lázně (5.2). Objem se doplní po rysku methanolem (4.6), promíchá se a alikvotní podíl se zfiltruje (5.5).

6.2 Chromatografické podmínky
Průtok: 1,0 ml/min.
Vlnová délka detektoru (5.3): 332 nm.
Objem nástřiku: 10 μl filtrovaného roztoku (6.1).
Měřená veličina: plocha píku.

6.3 Kalibrační křivka
Alespoň třikrát se nastříkne 10 μl každého standardního roztoku (4.12), změří se plocha píků a vypočte se průměrná hodnota pro každou koncentraci.
Sestrojí se kalibrační křivka a ověří se, zda tvoří přímku.

7. VÝPOČET

7.1 Z kalibrační křivky (6.3) se odečte množství bezvodého chininu v μg, obsaženého v nastříknutém objemu (6.2).

7.2 Koncentrace bezvodého chininu ve vzorku vyjádřená v hmotnostních procentech (% m/m) se vypočte ze vzorce:
$\%(m/m)\mathrm{bezvodého}\mathrm{chininu}=\frac{B}{A}$
kde

B =	množství bezvodého chininu v μg nalezené v 10 mikrolitrech zfiltrovaného roztoku (6.1),
A =	hmotnost vzorku v g (6.1).

8. OPAKOVATELNOST
Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) bezvodého chininu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,02 %.
Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) bezvodého chininu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,01 %.