33. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ BENZYLALKOHOLU
A. Kvalitativní stanovení
1. Rozsah a oblast použití
V této metodě je popsáno kvalitativní stanovení benzylalkoholu v kosmetických prostředcích.
2. Princip
Kvalitativní stanovení benzylalkoholu se provede chromatografií na tenké vrstvě na silikagelu.
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
3.1 Benzylalkohol
3.2 Chloroform
3.3 Ethanol, absolutní
3.4 n-Pentan
3.5 Mobilní fáze: diethylether
3.6 Standardní roztok benzylalkoholu: Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 0,1 g benzylalkoholu (3.1), doplní po rysku ethanolem (3.3) a promíchá.
3.7 Desky pro chromatografii na tenké vrstvě, skleněné, 100 x 200 mm nebo 200 x 200 mm, s nanesenou vrstvou silikagelu 60 F254 o tloušťce 0,25 mm.
3.8 Detekční činidlo: kyselina 12-molybdofosforečná, 10% (m/V) roztok v ethanolu (3.3).
4. Přístroje a pomůcky
4.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě
4.2 Chromatografická komora se dvěma žlábky, vnější rozměry přibližně 80 mm x 230 mm x 240 mm
4.3 Chromatografický papír: Whatman nebo ekvivalentní
4.4 UV lampa, vlnová délka 254 nm.
5. Postup
5.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky na 10 ml se naváží 1,0 g prostředku, který má být analyzován. Přidají se 3 ml chloroformu (3.2) a důkladně se třepe, dokud se prostředek nerozptýlí. Doplní se po rysku ethanolem (3.3) a důkladně třepe až do vzniku čirého nebo téměř čirého roztoku.
5.2 Chromatografie na tenké vrstvě
5.2.1 Chromatografická komora se nasytí (4.2) n-pentanem takto: strana komory sousedící se zadním žlábkem se vyloží chromatografickým papírem (4.3) tak, aby byl dolní okraj papíru ve žlábku. Zadní žlábek se naplní 25 ml n-pentanu (3.4) přelitím tohoto roztoku po povrchu chromatografického papíru. Okamžitě se nasadí víko a ponechá se stát 15 minut.
5.2.2 Do vhodných bodů na startovací linii chromatografické desky pro chromatografii na tenké vrstvě se nanese 10 μl roztoku vzorku (5.1) a 10 μl standardního roztoku benzylalkoholu (3.6). Nechá se vyschnout.
5.2.3 Do předního žlábku komory se odpipetuje 10 ml diethyletheru (3.5) a poté se do stejného žlábku ihned umístí deska (5.2.2). Opět se rychle nasadí víko komory a deska se vyvíjí do výšky 150 mm. Deska se vyjme z chromatografické komory a nechá se schnout při pokojové teplotě.
5.2.4 Deska (5.2.3) se pozoruje pod ultrafialovým světlem a označí se poloha fialových skvrn. Deska se postříká detekčním činidlem (3.8) a poté se zahřeje 15 minut při 120 °C. Benzylalkohol se jeví jako tmavě modrá skvrna.
5.2.5 Vypočte se hodnota Rf získaná pomocí standardního roztoku benzylalkoholu. Tmavě modrá skvrna se stejnou hodnotou Rf získaná z roztoku vzorku indikuje přítomnost benzylalkoholu.
Mez detekce: 0,1 μg benzylalkoholu.
B. Kvantitativní stanovení
1. Rozsah a oblast použití
V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení obsahu benzylalkoholu v kosmetických prostředcích.
2. Definice
Množství benzylalkoholu stanovené touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (% m/m).
3. Princip
Vzorek se extrahuje methanolem a množství benzylalkoholu v extraktu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).
4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC.
4.1 Methanol
4.2 4-Ethoxyfenol
4.3 Benzylalkohol
4.4 Mobilní fáze: methanol (4.1)/voda (45:55; V/V)
4.5 Zásobní roztok benzylalkoholu: do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží asi 0,1 g benzylalkoholu (4.3). Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.
4.6 Zásobní roztok vnitřního standardu: do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 0,1 g 4-ethoxyfenolu (4.2) přesně. Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.
4.7 Standardní roztoky: Do série odměrných baněk na 25 ml se odpipetuje zásobní roztok benzylalkoholu (4.5) a zásobní roztok vnitřního standardu (4.6) podle níže uvedené tabulky. Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.
| Standardní roztok | Koncentrace benzylalkoholu | Koncentrace 4-ethoxyfenolu | ||
| počet přidaných ml (4.5) | μg/ml (*) | počet přidaných ml (4.6) | μg/ml (*) | |
| I | 0,5 | 20 | 2,0 | 80 |
| II | 1,0 | 40 | 2,0 | 80 |
| III | 2,0 | 80 | 2,0 | 80 |
| IV | 3,0 | 120 | 2,0 | 80 |
| V | 4,0 | 200 | 2,0 | 80 |
| (*) Tyto hodnoty jsou uvedeny jako ukazatele a odpovídají koncentracím standardních roztoků připravených z roztoků benzylalkoholu (4.5) a 4-ethoxyfenolu (4.6), které obsahují přesně 0,1 % (m/V) benzylalkoholu a přesně 0,1 % (m/V) 4-ethoxyfenolu. | ||||
5. Přístroje a pomůcky
5.1 Obvyklé laboratorní vybavení
5.2 Zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a s nastřikovací smyčkou o objemu 10 μl
5.3 Analytická kolona: kolona z nerezové oceli: 250 mm x 4,6 mm s náplní Spherisorb ODS o velikosti částic 5 μm nebo s ekvivalentní náplní.
5.4 Vodní lázeň
5.5 Ultrazvuková lázeň
5.6 Odstředivka
5.7 Centrifugační kyvety na 15 ml
6. Postup
6.1 Příprava vzorku
6.1.1 Do centrifugační kyvety (5.7) se naváží asi 0,1 g (m gramů) vzorku přesně a přidá se 5 ml methanolu (4.1).
6.1.2 Zahřívá se po dobu 10 minut na vodní lázni (5.4) nastavené na teplotu 50 °C a poté se vloží do ultrazvukové lázně (5.5), kde se ponechá do důkladného rozptýlení vzorku.
6.1.3 Ochladí se a poté se odstředí 5 minut při 3 500 ot./min.
6.1.4 Supernatant se převede do odměrné baňky na 25 ml.
6.1.5 Zbytek vzorku se extrahuje dalšími 5 ml methanolu (4.1). Extrakty se sloučí v odměrné baňce na 25 ml.
6.1.6 Do odměrné baňky na 25 ml se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vnitřního standardu (4.6). Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá se. Tento roztok se použije pro chromatografii popsanou v bodě 6.4.
6.2 Chromatografie
6.2.1 Obvyklým způsobem se sestaví zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (5.2). Průtoková rychlost mobilní fáze (4.4) se nastaví na 2,0 ml/min.
6.2.2 Vlnová délka UV detektoru (5.2) se nastaví na 210 nm.
6.3 Kalibrace
6.3.1 Nastříkne se po 10 μl každého ze standardních roztoků benzylalkoholu (4.7) a změří se plocha píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu.
6.3.2 Pro každý standardní roztok benzylalkoholu (4.7) se vypočte poměr plochy píku benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu. Kalibrační křivka se sestrojí vynesením těchto poměrů na osu y a odpovídajících koncentrací benzylalkoholu v μg/ml na osu x.
6.4 Kvantitativní stanovení
6.4.1 Na kolonu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku (6.1.6) a změří se plochy píků benzylalkoholu 4-ethoxyfenolu. Vypočítá se poměr ploch píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu. Tento postup se opakujte s dalšími s alikvotními podíly po 10 μl roztoku vzorku, dokud se nezískají shodné výsledky.
6.4.2 Z kalibrační křivky (6.3.2) se odečte koncentrace benzylalkoholu odpovídající poměru ploch píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu.
7. Výpočet
Obsah benzylalkoholu ve vzorku v hmotnostních procentech se vypočítá podle vzorce:
kde
| m = | hmotnost analyzovaného vzorku (6.1.1) v g, |
| c = | koncentrace benzylalkoholu v roztoku vzorku (6.1.1) v μg/ml, odečtená z kalibrační křivky. |
8. Opakovatelnost
Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) benzylalkoholu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.