B. Kvantitativní stanovení
1. Rozsah a oblast použití
V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení obsahu benzylalkoholu v kosmetických prostředcích.
2. Definice
Množství benzylalkoholu stanovené touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (% m/m).
3. Princip
Vzorek se extrahuje methanolem a množství benzylalkoholu v extraktu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).
4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC.
4.1 Methanol
4.2 4-Ethoxyfenol
4.3 Benzylalkohol
4.4 Mobilní fáze: methanol (4.1)/voda (45:55; V/V)
4.5 Zásobní roztok benzylalkoholu: do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží asi 0,1 g benzylalkoholu (4.3). Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.
4.6 Zásobní roztok vnitřního standardu: do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 0,1 g 4-ethoxyfenolu (4.2) přesně. Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.
4.7 Standardní roztoky: Do série odměrných baněk na 25 ml se odpipetuje zásobní roztok benzylalkoholu (4.5) a zásobní roztok vnitřního standardu (4.6) podle níže uvedené tabulky. Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá.
| Standardní roztok | Koncentrace benzylalkoholu | Koncentrace 4-ethoxyfenolu | ||
| počet přidaných ml (4.5) | μg/ml (*) | počet přidaných ml (4.6) | μg/ml (*) | |
| I | 0,5 | 20 | 2,0 | 80 |
| II | 1,0 | 40 | 2,0 | 80 |
| III | 2,0 | 80 | 2,0 | 80 |
| IV | 3,0 | 120 | 2,0 | 80 |
| V | 4,0 | 200 | 2,0 | 80 |
| (*) Tyto hodnoty jsou uvedeny jako ukazatele a odpovídají koncentracím standardních roztoků připravených z roztoků benzylalkoholu (4.5) a 4-ethoxyfenolu (4.6), které obsahují přesně 0,1 % (m/V) benzylalkoholu a přesně 0,1 % (m/V) 4-ethoxyfenolu. | ||||
5. Přístroje a pomůcky
5.1 Obvyklé laboratorní vybavení
5.2 Zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a s nastřikovací smyčkou o objemu 10 μl
5.3 Analytická kolona: kolona z nerezové oceli: 250 mm x 4,6 mm s náplní Spherisorb ODS o velikosti částic 5 μm nebo s ekvivalentní náplní.
5.4 Vodní lázeň
5.5 Ultrazvuková lázeň
5.6 Odstředivka
5.7 Centrifugační kyvety na 15 ml
6. Postup
6.1 Příprava vzorku
6.1.1 Do centrifugační kyvety (5.7) se naváží asi 0,1 g (m gramů) vzorku přesně a přidá se 5 ml methanolu (4.1).
6.1.2 Zahřívá se po dobu 10 minut na vodní lázni (5.4) nastavené na teplotu 50 °C a poté se vloží do ultrazvukové lázně (5.5), kde se ponechá do důkladného rozptýlení vzorku.
6.1.3 Ochladí se a poté se odstředí 5 minut při 3 500 ot./min.
6.1.4 Supernatant se převede do odměrné baňky na 25 ml.
6.1.5 Zbytek vzorku se extrahuje dalšími 5 ml methanolu (4.1). Extrakty se sloučí v odměrné baňce na 25 ml.
6.1.6 Do odměrné baňky na 25 ml se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vnitřního standardu (4.6). Doplní se po rysku methanolem (4.1) a promíchá se. Tento roztok se použije pro chromatografii popsanou v bodě 6.4.
6.2 Chromatografie
6.2.1 Obvyklým způsobem se sestaví zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (5.2). Průtoková rychlost mobilní fáze (4.4) se nastaví na 2,0 ml/min.
6.2.2 Vlnová délka UV detektoru (5.2) se nastaví na 210 nm.
6.3 Kalibrace
6.3.1 Nastříkne se po 10 μl každého ze standardních roztoků benzylalkoholu (4.7) a změří se plocha píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu.
6.3.2 Pro každý standardní roztok benzylalkoholu (4.7) se vypočte poměr plochy píku benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu. Kalibrační křivka se sestrojí vynesením těchto poměrů na osu y a odpovídajících koncentrací benzylalkoholu v μg/ml na osu x.
6.4 Kvantitativní stanovení
6.4.1 Na kolonu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku (6.1.6) a změří se plochy píků benzylalkoholu 4-ethoxyfenolu. Vypočítá se poměr ploch píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu. Tento postup se opakujte s dalšími s alikvotními podíly po 10 μl roztoku vzorku, dokud se nezískají shodné výsledky.
6.4.2 Z kalibrační křivky (6.3.2) se odečte koncentrace benzylalkoholu odpovídající poměru ploch píků benzylalkoholu a 4-ethoxyfenolu.
7. Výpočet
Obsah benzylalkoholu ve vzorku v hmotnostních procentech se vypočítá podle vzorce:
kde
| m = | hmotnost analyzovaného vzorku (6.1.1) v g, |
| c = | koncentrace benzylalkoholu v roztoku vzorku (6.1.1) v μg/ml, odečtená z kalibrační křivky. |
8. Opakovatelnost
Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) benzylalkoholu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.