B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY BENZOOVÉ, KYSELINY 4-HYDROXYBENZOOVÉ, KYSELINY SORBOVÉ A KYSELINY SALICYLOVÉ

1. Princip
Vzorek se po okyselení extrahuje směsí ethanolu a vody. Po filtraci se konzervanty stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

2. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

2.1 Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

2.2 Ethanol, absolutní

2.3 Kyselina 4-hydroxybenzoová

2.4 Kyselina salicylová

2.5 Kyselina benzoová

2.6 Kyselina sorbová

2.7 Octan sodný, (CH₃COONa·3H₂O)

2.8 Kyselina octová,$d_4^{20}=1,05g/\mathrm{ml}$

2.9 Acetonitril

2.10 Kyselina sírová, 2 mol/l

2.11 Hydroxid draselný, 0,2 mol/l vodný roztok

2.12 Kyselina 2-methoxybenzoová

2.13 Směs ethanol/voda
Devět dílů ethanolu (2.2) se smíchá s jedním dílem vody (2:1)

2.14 Roztok vnitřního standardu
Připraví se roztok obsahující 1 g kyseliny 2-methoxybenzoové (2.12) v 500 ml směsi ethanol/voda (2.13).

2.15 Mobilní fáze pro HPLC

2.15.1 Acetátový tlumivý roztok: do 1 litru vody se přidá 6,35 g octanu sodného (2.7) a 20,0 ml kyseliny octové (2.8) a smíchá se.

2.15.2 Mobilní fáze se připraví smícháním devíti dílů acetátového tlumivýho roztoku (2.15.1) a jednoho dílu acetonitrilu (2.9).

2.16 Zásobní roztok konzervantů
Do odměrné baňky na 50 ml se naváží asi 0,05 g kyseliny 4-hydroxybenzoové (2.3), 0,2 g kyseliny salicylové (2.4), 0,2 g kyseliny benzoové (2.5) a 0,05 g kyseliny sorbové (2,6) přesně a objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Roztok se uchovává v ledničce. Roztok je stabilní jeden týden.

2.17 Standardní roztoky konzervantů
Do odměrných baněk na 20 ml se odměří 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 a 0,50 ml zásobního roztoku (2.16). Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (2.14) a 0,5 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10). Objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Tyto roztoky musí být připravovány čerstvé.

3. Přístroje a pomůcky
Obvyklé laboratorní vybavení, které není nijak specifikováno a

3.1 Vodní lázeň, nastavená na 60 °C

3.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a 10μl nastřikovací smyčkou

3.3 Analytická kolona
Nerezová ocel, délka 12,5 až 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentní náplní

3.4 Filtrační papír, průměr: 90 mm, Schleicher and Schüll, Weissband No 5892 nebo ekvivalentní

3.5 Erlenmeyerovy baňky na 50 ml

3.6 Skleněné vzorkovací lahvičky na 5 ml

3.7 Varné kamínky, karborundum, velikost 2 – 4 mm, nebo ekvivalentní

4. Postup

4.1 Příprava vzorku

4.1.1 Příprava vzorku bez přidání vnitřního standardu
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se naváží 1 g vzorku. Do baňky se odpipetuje 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7), zkumavka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.
Baňka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se na hodinu uloží při 5 °C.
Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

4.1.2 Příprava vzorku s přidáním vnitřního standardu
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g vzorku (a gramů). Pipetou se přidá 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 30,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7) a 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.
Zkumavka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se uloží na hodinu při 5 °C.
Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

4.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Mobilní fáze: acetonitril/acetátový tlumivý roztok (2.15).
Průtok mobilní fáze kolonou se nastaví na 2,0 ± 0,5 ml/min. Vlnová délka detektoru se nastaví na 240 nm.

4.2.1 Kalibrace
Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne po 10 μl standardních roztoků konzervantů (2.17). Pro každý roztok se ze získaných chromatogramů stanoví poměr výšky píku vyšetřovaného konzervantu k výšce píku vnitřního standardu získaného z chromatogramů. Sestrojí se graf závislosti poměru výšek píků na koncentraci každého standardního roztoku.
Přesvědčte se, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

4.2.2 Stanovení
Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne 10 μl extraktu vzorku (4.1.1) a zaznamená se chromatogram. Nastříkne se 10 μl standardního roztoku konzervantu (2.17) a zaznamená se chromatogram. Obdržené chromatogramy se porovnají. Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) žádný pík s přibližně stejným retenčním časem jako pík kyseliny 2-methoxybenzoové (doporučený vnitřní standard), nastříkne se do kapalinového chromatografu 10 μl extraktu vzorku s přidaným vnitřním standardem (4.1.2) a zaznamená se chromatogram.
Je-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) rušivý pík se stejným retenčním časem jako kyselina 2-methoxybenzoová, měl by být vybrán jiný vnitřní standard. (Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.)
Je třeba se ujistit, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.
Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:
— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 12);

Obrázek 12: Rozlišení píků
Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;
— faktor asymetrie A_s všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 13) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost papíru 2 cm/min.

Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
— Základna musí být stabilní.

5. Výpočet
Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použijí poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů a výšky píku kyseliny 2-methoxybenzoové (vnitřní standard) a dále kalibrační graf. Obsah kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny sorbové nebo kyseliny salicylové ve vzorku v hmotnostních procentech (x_i) se vypočte pomocí vzorce
$x_i\%m/m=\frac{100·20·b}{{10}^6·a}=\frac{b}{500·a}$
kde

a =	hmotnost zkušebního vzorku (4.1.2) (g),
b =	koncentrace konzervantu v extraktu vzorku (4.1.2) (μl/ml) odečtená z kalibračního grafu.

6. Opakovatelnost
Pro výrobky obsahující asi 0,4 % (m/m) kyseliny 4-hydroxybenzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.
Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny benzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,050 %.
Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny salicylové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,045 %.
Pro výrobky obsahující asi 0,6 % (m/m) kyseliny sorbové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.

7. Poznámky

7.1 Výsledky testování robustnosti metody ukazují, že množství kyseliny sírové přidané do extraktu kyselin ze vzorku je rozhodující a množství zpracovávaného vzorku by tedy mělo být v předepsaném rozmezí.

7.2 Je-li to žádoucí, lze použít vhodnou ochrannou kolonu.