4.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Mobilní fáze: acetonitril/acetátový tlumivý roztok (2.15).
Průtok mobilní fáze kolonou se nastaví na 2,0 ± 0,5 ml/min. Vlnová délka detektoru se nastaví na 240 nm.

4.2.1 Kalibrace
Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne po 10 μl standardních roztoků konzervantů (2.17). Pro každý roztok se ze získaných chromatogramů stanoví poměr výšky píku vyšetřovaného konzervantu k výšce píku vnitřního standardu získaného z chromatogramů. Sestrojí se graf závislosti poměru výšek píků na koncentraci každého standardního roztoku.
Přesvědčte se, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

4.2.2 Stanovení
Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne 10 μl extraktu vzorku (4.1.1) a zaznamená se chromatogram. Nastříkne se 10 μl standardního roztoku konzervantu (2.17) a zaznamená se chromatogram. Obdržené chromatogramy se porovnají. Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) žádný pík s přibližně stejným retenčním časem jako pík kyseliny 2-methoxybenzoové (doporučený vnitřní standard), nastříkne se do kapalinového chromatografu 10 μl extraktu vzorku s přidaným vnitřním standardem (4.1.2) a zaznamená se chromatogram.
Je-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) rušivý pík se stejným retenčním časem jako kyselina 2-methoxybenzoová, měl by být vybrán jiný vnitřní standard. (Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.)
Je třeba se ujistit, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.
Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:
— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 12);

Obrázek 12: Rozlišení píků
Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;
— faktor asymetrie A_s všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 13) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost papíru 2 cm/min.

Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
— Základna musí být stabilní.