37. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HYDROCHINONU, HYDROCHINON-MONOMETHYLETHERU, HYDROCHINON-MONOETHYLETHERU A HYDROCHINON- MONOBENZYLETHERU V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH
A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
1. Rozsah a oblast použití
V metodě je popsána detekce a kvalitativní stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru (monobenzonu) v kosmetických prostředcích pro zesvětlení kůže.
2. Podstata metody
Kvalitativní stanovení hydrochinonu a jeho etherů se provede chromatografií na tenké vrstvě (TLC).
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
3.1 Ethanol, 96% (V/V)
3.2 Chloroform
3.3 Diethylether
3.4 Mobilní fáze:
Chloroform/diethylether, 66:33 (V/V)
3.5 Amoniak, 25% (m/m)
3.6 Kyselina askorbová
3.7 Hydrochinon
3.8 Hydrochinon-monomethylether
3.9 Hydrochinon-monoethylether
3.10 Hydrochinon-monobenzylether (monobenzon)
3.11 Standardní roztoky
Následující standardní roztoky se připravují čerstvé a jsou stabilní jeden den.
3.11.1 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinonu (3.7). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.11.2 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monomethyletheru (3.8). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.11.3 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monoethyletheru (3.9). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.11.4 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.10). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.12 Dusičnan stříbrný
3.13 Kyselina 12-molybdofosforečná
3.14 Kyanoželezitan draselný hexahydrát
3.15 Chlorid železitý hexahydrát
3.16 Detekční činidla
3.16.1 Do 5% vodného roztoku (m/V) dusičnanu stříbrného (3.12) se přidává amoniak (3.5), dokud se tvořící se sraženina opět nerozpustí.
Upozornění:
Při delším stání se v roztoku tvoří výbušné sloučeniny a měl by být po použití zlikvidován.
3.16.2 10% (m/V) roztok kyseliny 12-molybdofosforečné (3.13) v ethanolu (3.1).
3.16.3 Připraví se 1 % (m/V) vodný roztok kyanoželezitanu draselného (3.14) a 2% (m/V) vodný roztoku chloridu železitého (3.15). Těsně před použitím se smíchají stejné díly obou roztoků.
4. Přístroje a pomůcky
Obvyklé laboratorní vybavení, a
4.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě
4.2 Hotové TLC desky: silikagel GHR/UV254; 20 x 20 cm (Machery, Nagel nebo ekvivalentní). Tloušťka vrstvy 0,25 mm.
4.3 Ultrazvuková lázeň
4.4 Odstředivka
4.5 UV lampa, 254 nm
5. Postup
5.1 Příprava vzorku
Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 3,0 g vzorku. Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). pH roztoku se upraví amoniakem (3.5) na 10. Objem se doplní ethanolem (3.1) na 10 ml. Zkumavka se uzavře zátkou a homogenizuje se 10 minut v ultrazvukové lázni. Zfiltruje se přes filtrační papír nebo se odstředí při 3 000 ot./min.
5.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)
5.2.1 Chromatografická komora se nasytí mobilní fází (3.4).
5.2.2 Na desku se nanese po 2 μl standardních roztoků (3.11) a 2 μl roztoku vzorku (5.1). Vyvíjí se ve tmě při teplotě okolí, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm od startu.
5.2.3 Deska se vyjme, nechá se vyschnout při laboratorní teplotě.
5.3 Detekce
5.3.1 Deska se pozoruje pod UV světem při 254 nm a poloha skvrn se označí.
5.3.2 Deska se postříká
— dusičnanem stříbrným (3.16.1), nebo
— kyselinou 12-molybdofosforečnou (3.16.2); zahřeje se na asi 120 °C; nebo
— roztokem kyanoželezitanu draselného a roztokem chloridu železitého (3.16.3).
6. Kvalitativní stanovení
Spočítá se hodnota Rf každé skvrny.
Skvrny získané pro roztok vzorku se porovnají se skvrnami získanými pro standardní roztoky, pokud jde o jejich hodnoty Rf, barvu skvrn v UV světle a barvu skvrn po zviditelnění detekčním činidlem.
Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v následujícím oddílu (B) a porovnají se retenční časy získané pro pík (píky) vzorku s retenčními časy píků referenčních roztoků.
Výsledky z TLC a HPLC se zkombinují s cílem dokázat přítomnost hydrochinonu a/nebo jeho etherů.
7. Poznámky
Za uvedených podmínek byly pozorovány následující hodnoty Rf:
| hydrochinon: | 0,32 |
| hydrochinon-monomethylether: | 0,53 |
| hydrochinon-monoethylether: | 0,55 |
| hydrochinon-monobenzylether: | 0,58 |
B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
1. Rozsah a oblast použití
V metodě je specifikován postup pro stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru v kosmetických prostředcích pro zesvětlení pleti.
2. Princip
Vzorek je extrahován směsí voda/methanol za mírného zahřátí, kterým se rozpustí tukový materiál. Kvantitativní stanovení analytů ve výsledném roztoku se provede kapalinovou chromatografií s obrácenou fází s UV detekcí.
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
3.1 Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.
3.2 Methanol
3.3 Hydrochinon
3.4 Hydrochinon-monomethylether
3.5 Hydrochinon-monoethylether
3.6 Hydrochinon-monobenzylether (monobenzon)
3.7 Tetrahydrofuran, čistoty pro HPLC
3.8 Směs voda/methanol 1:1 (V/V). Smíchá se jeden díl vody a jeden díl methanolu (3.2).
3.9 Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda 45:55 (V/V). Smíchá se 45 dílů tetrahydrofuranu (3.7) a 55 dílů vody.
3.10 Standardní roztok
Do odměrné baňky na 50 ml se naváží 0,06 g hydrochinonu (3.3), 0,08 g hydrochinon-monomethyletheru (3.4), 0,10 g hydrochinon-monoethyletheru (3.5) a 0,12 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.6). Rozpustí se a doplní se na objem methanolem (3.2). Standardní roztok se připraví zředěním 10,00 ml tohoto roztoku na 50,00 ml směsí voda/methanol (3.8). Tyto roztoky se připravují čerstvé.
4. Přístroje a pomůcky
Obvyklé laboratorní vybavení
4.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C
4.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a 10μl nastřikovací smyčkou
4.3 Analytická kolona:
Chromatografická kolona z nerezové oceli, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Zorbax fenylem (chemicky vázaným fenethylsilanem na Zorbaxu SIL, uzavřená trimethylchlorsilanem), velikost částic 6 μm, nebo ekvivalentní náplní. Nepoužívá se ochranná kolona, s výjimkou fenylové kolony nebo kolony s ekvivalentní náplní.
4.4 Filtrační papír, průměr 90 mm, Schleicher and Schüll, Weissband No 5892 nebo ekvivalentní
5. Postup
5.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky na 50 ml se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g (a gramů) vzorku. Vzorek se rozptýlí ve 25 ml směsi voda/methanol (3.8). Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud se nevytvoří homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se umístí do vodní lázně (4.1) nastavené na 60 °C, aby se usnadnila extrakce. Baňka se ochladí a doplní se na objem směsí voda/methanol (3.8). Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (4.4). Kvalitativní stanovení HPLC se provede do 24 hodin od přípravy extraktu.
5.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
5.2.1 Průtoková rychlost mobilní fáze (3.9) se upraví na 1,0 ml/min a vlnová délka detektoru se nastaví na 295 nm.
5.2.2 Nastříkne se 10 μl roztoku vzorku získaného podle bodu 5.1 a zaznamená se chromatogram. Změří se plochy píků. Provede se kalibrace podle bodu 5.2.3. Porovnají se chromatogramy získané pro vzorek a standardní roztoky. Pro výpočet koncentrace analytu v roztoku vzorku se použijí plochy píků a faktory odezvy (RF) vypočtené podle 5.2.3.
5.2.3 Kalibrace
Nastříkne se 10 μl standardního roztoku (3.10) a zaznamená se chromatogram. Nástřik se provede několikrát, dokud není plocha píku konstantní.
Stanoví se faktor odezvy RFi:
kde
| pi = | plocha píku pro hydrochinon, hydrochinon-monomethylether, hydrochinon- monoethylether nebo hydrochinon- monobenzylether |
| ci = | koncentrace hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon- monoethyletheru nebo hydrochinon-monobenzyletheru v standardním roztoku (3.10) (g/50 ml). |
Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:
— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 14);
Obrázek 14: Rozlišení píků
Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;
— faktor asymetrie As všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 15) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.
Obrázek 15: Faktor asymetrie píku
— Základna musí být stabilní.
6. Výpočet
Pro výpočet koncentrace analytu (koncentrací analytů) ve vzorku se použijí plochy píků analytů. Koncentrace analytu ve vzorku vyjádřená v hmotnostních procentech (xi) se vypočte pomocí vzorce
kde
| a = | hmotnost vzorku v g, |
| bi = | plocha píku analytu i ve vzorku. |
7. Opakovatelnost
7.1 Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) hydrochinonu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,13 %.
7.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monomethyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,1%.
7.3 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monoethyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,11%.
7.4 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monobenzyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,11%.
8. Reprodukovatelnost
8.1 Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) hydrochinonu nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,37 %.
8.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monomethyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,21 %.
8.3 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monoethyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,19%.
8.4 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monobenzyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,11%.
9. Poznámky
9.1 Je-li zjištěn obsah hydrochinonu výrazně vyšší než 2 % a je požadován přesný odhad obsahu, měl by se extrakt vzorku (5.1) zředit na podobnou koncentraci, kterou by měl vzorek obsahující 2 % hydrochinonu, a stanovení se opakuje.
(U některých přístrojů může při vysokých koncentracích hydrochinonu ležet hodnota absorbance mimo lineární rozsah detektoru.)
9.2 Rušivé vlivy
Výše popsaná metoda umožňuje stanovení hydrochinonu a jeho etherů v jednom izokratickém průběhu. Použití fenylové kolony zajistí dostatečnou retenci hydrochinonu, kterou nelze zajistit při použití kolony C18 s uvedenou mobilní fází.
U této metody však snadno dochází k rušivému vlivu celé řady parabenů. V takovém případě by stanovení mělo být zopakováno s jiným systémem mobilní fáze/stacionární fáze. Vhodné metody lze najít v odkazech:
„Magnesium as modifier for the determination of baryum by flame atomic emission spectrometry“. Jerrow M. et al., Analytical proceedings, 1991, 28, 40.
M. Herpol-Borremans et. M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydro-quinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986).
Kolona:Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 mm nebo ekvivalentní:
teplota: 36 °C
průtok: 1,5 ml/min
mobilní fáze:
pro hydrochinon: methanol/voda 5/95 (V/V)
pro hydrochinon-monomethylether: methanol/voda 30/70 (V/V)
pro hydrochinon-monobenzylether: methanol/voda 80/20(V/V).
Kolona: Spherisorb S5-ODS nebo ekvivalentní:
mobilní fáze: voda/methanol 90/10 (V/V)
průtok: 1,5 ml/min
Tyto podmínky jsou vhodné pro hydrochinon (J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129).