A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
1. Rozsah a oblast použití
V metodě je popsána detekce a kvalitativní stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru (monobenzonu) v kosmetických prostředcích pro zesvětlení kůže.
2. Podstata metody
Kvalitativní stanovení hydrochinonu a jeho etherů se provede chromatografií na tenké vrstvě (TLC).
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
3.1 Ethanol, 96% (V/V)
3.2 Chloroform
3.3 Diethylether
3.4 Mobilní fáze:
Chloroform/diethylether, 66:33 (V/V)
3.5 Amoniak, 25% (m/m)
3.6 Kyselina askorbová
3.7 Hydrochinon
3.8 Hydrochinon-monomethylether
3.9 Hydrochinon-monoethylether
3.10 Hydrochinon-monobenzylether (monobenzon)
3.11 Standardní roztoky
Následující standardní roztoky se připravují čerstvé a jsou stabilní jeden den.
3.11.1 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinonu (3.7). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.11.2 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monomethyletheru (3.8). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.11.3 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monoethyletheru (3.9). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.11.4 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.10). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
3.12 Dusičnan stříbrný
3.13 Kyselina 12-molybdofosforečná
3.14 Kyanoželezitan draselný hexahydrát
3.15 Chlorid železitý hexahydrát
3.16 Detekční činidla
3.16.1 Do 5% vodného roztoku (m/V) dusičnanu stříbrného (3.12) se přidává amoniak (3.5), dokud se tvořící se sraženina opět nerozpustí.
Upozornění:
Při delším stání se v roztoku tvoří výbušné sloučeniny a měl by být po použití zlikvidován.
3.16.2 10% (m/V) roztok kyseliny 12-molybdofosforečné (3.13) v ethanolu (3.1).
3.16.3 Připraví se 1 % (m/V) vodný roztok kyanoželezitanu draselného (3.14) a 2% (m/V) vodný roztoku chloridu železitého (3.15). Těsně před použitím se smíchají stejné díly obou roztoků.
4. Přístroje a pomůcky
Obvyklé laboratorní vybavení, a
4.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě
4.2 Hotové TLC desky: silikagel GHR/UV254; 20 x 20 cm (Machery, Nagel nebo ekvivalentní). Tloušťka vrstvy 0,25 mm.
4.3 Ultrazvuková lázeň
4.4 Odstředivka
4.5 UV lampa, 254 nm
5. Postup
5.1 Příprava vzorku
Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 3,0 g vzorku. Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). pH roztoku se upraví amoniakem (3.5) na 10. Objem se doplní ethanolem (3.1) na 10 ml. Zkumavka se uzavře zátkou a homogenizuje se 10 minut v ultrazvukové lázni. Zfiltruje se přes filtrační papír nebo se odstředí při 3 000 ot./min.
5.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)
5.2.1 Chromatografická komora se nasytí mobilní fází (3.4).
5.2.2 Na desku se nanese po 2 μl standardních roztoků (3.11) a 2 μl roztoku vzorku (5.1). Vyvíjí se ve tmě při teplotě okolí, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm od startu.
5.2.3 Deska se vyjme, nechá se vyschnout při laboratorní teplotě.
5.3 Detekce
5.3.1 Deska se pozoruje pod UV světem při 254 nm a poloha skvrn se označí.
5.3.2 Deska se postříká
— dusičnanem stříbrným (3.16.1), nebo
— kyselinou 12-molybdofosforečnou (3.16.2); zahřeje se na asi 120 °C; nebo
— roztokem kyanoželezitanu draselného a roztokem chloridu železitého (3.16.3).
6. Kvalitativní stanovení
Spočítá se hodnota Rf každé skvrny.
Skvrny získané pro roztok vzorku se porovnají se skvrnami získanými pro standardní roztoky, pokud jde o jejich hodnoty Rf, barvu skvrn v UV světle a barvu skvrn po zviditelnění detekčním činidlem.
Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v následujícím oddílu (B) a porovnají se retenční časy získané pro pík (píky) vzorku s retenčními časy píků referenčních roztoků.
Výsledky z TLC a HPLC se zkombinují s cílem dokázat přítomnost hydrochinonu a/nebo jeho etherů.
7. Poznámky
Za uvedených podmínek byly pozorovány následující hodnoty Rf:
| hydrochinon: | 0,32 |
| hydrochinon-monomethylether: | 0,53 |
| hydrochinon-monoethylether: | 0,55 |
| hydrochinon-monobenzylether: | 0,58 |