A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
1. Rozsah a oblast použití
V této metodě je specifikován postup chromatografie na tenké vrstvě, který v kombinaci s metodou kvantitativního stanovení, popsanou v oddílu B, umožní identifikaci 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.
2. Princip
Konzervační přísady se extrahují z okyselených vzorků kosmetických prostředků acetonem. Po filtraci se acetonový roztok smíchá s vodou a mastné kyseliny se v alkalickém prostředí vysrážejí jako vápenaté soli. Alkalická směs aceton/voda je extrahována diethyletherem, čímž se odstraní lipofilní látky. Po okyselení se konzervační přísady extrahují diethyletherem. Alikvotní část diethyletherového extraktu se nanese na desku pokrytou tenkou vrstvou silikagelu. Po vyvíjení se získaný chromatogram pozoruje v UV světle a zviditelní se za použití Millonova činidla.
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
3.1 Všeobecně
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.
3.2 Aceton
3.3 Diethylether
3.4 n-Pentan
3.5 Methanol
3.6 Kyselina octová, ledová
3.7 Roztok kyseliny chlorovodíkové, 4 mol/l
3.8 Roztok hydroxidu draselného, 4 mol/l
3.9 Chlorid vápenatý dihydrát (CaCl2·2H2O)
3.10 Detekční činidlo: Millonovo činidlo
Millonovo činidlo (dusičnan rtuťnatý) je komerčně dostupný roztok (Fluka 69820).
3.11 2-Fenoxyethanol
3.12 1-Fenoxy-propan-2-ol
3.13 Methyl-4-hydroxybenzoát (methylparaben)
3.14 Ethyl-4-hydroxybenzoát (ethylparaben)
3.15 n-Propyl-4-hydroxybenzoát (propylparaben)
3.16 n-Butyl-4-hydroxybenzoát (butylparaben)
3.17 Benzyl-4-hydroxybenzoát (benzylparaben)
3.18 Standardní roztoky
Připraví se 0,1% (m/V) roztoky každé z referenčních látek 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 a 3.17 v methanolu.
3.19 Mobilní fáze
Smíchá se 88 dílů n-pentanu (3.4) s 12 díly ledové kyseliny octové (3.6).
4 Přístroje a pomůcky
Běžné laboratorní vybavení a
4.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C
4.2 Vyvíjecí komora (nevyložená filtračním papírem)
4.3 Zdroj ultrafialového světla, 254 nm
4.4 Hotové desky 20 cm x 20 cm se sorbční vrstvou: silikagel 60F254 (fluorescenční indikátor), tloušťka vrstvy: 0,25 mm, s koncentrační zónou 25 x 200 mm (Merck No 11798, Darmstadt, nebo ekvivalentní)
4.5 Sušárna nastavitelná na teplotu až do 105 °C
4.6 Horkovzdušný fén
4.7 Vlněný malířský váleček o délce přibližně 10 cm, vnější průměr přibližně 3,5 cm. Vlněná vrstva by měla být 2 až 3 mm silná. Podle potřeby se vlna zastřihne.
Viz poznámka v bodě 5.2.
4.8 Erlenmeyerovy baňky na 50 a 200 ml, se zábrusovou zátkou
4.9 Elektrická topná deska s termostatem. Nastavení teploty: asi 80 °C. Topná deska se pokryje hliníkovou deskou o velikosti 20 cm x 20 cm a tloušťce asi 6 mm, čímž se dosáhne rovnoměrného rozložení tepla.
5. Postup
5.1 Příprava vzorku
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (4.8.) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.7) a 40 ml acetonu.
V případě silně zásaditých kosmetických přípravků, jako je toaletní mýdlo, se přidá 20 kapek roztoku kyseliny chlorovodíkové. Baňka se uzavře, směs se zlehka zahřeje na asi 60 °C, aby se usnadnila extrakce konzervačních látek do acetonové fáze, a 1 minutu se silně třepe.
Indikátorovým papírkem se změří pH roztoku a upraví se na hodnotu ≤3 roztokem kyseliny chlorovodíkové. Znovu se 1 minutu silně třepe.
Roztok se ochladí na laboratorní teplotu a zfiltruje se přes filtrační papír do Erlenmeyerovy baňky. 20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 60 ml vody a promíchá. Hodnota pH směsi se upraví hydroxidem draselným (3.8.) přibližně na 10 za použití indikátorového papírku.
Přidá se 1 g chloridu vápenatého dihydrátu (3.9) a silně se protřepe.
Roztok se zfiltruje přes filtrační papír do dělicí nálevky na 250 ml, která obsahuje 75 ml diethyletheru, a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a vodná fáze se vypustí do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml. Hodnota pH roztoku se upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové na přibližně 2 za použití indikátorového papírku. Poté se přidá 10 ml diethyletheru a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a asi 2 ml fáze diethyletheru se převede do vzorkovací lahvičky na 5 ml.
5.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)
TLC deska se umístí na zahřátou hliníkovou desku (4.9.) Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky se nanese 10 μl každého z referenčních roztoků a 100 μl roztoku vzorku (vzorků) (5.1).
Podle potřeby lze podpořit odpaření rozpouštědla proudem vzduchu. TLC deska se odstraní z topné desky a nechá se vychladnout na laboratorní teplotu. Vyvíjecí komora (4.2) se naplní 100 ml mobilní fází (3.19).
TLC deska se ihned vloží do nenasycené komory a vyvíjí se při laboratorní teplotě, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí asi 15 cm od základní linie. Deska se z vyvíjecí komory vyjme a vysuší v proudu horkého vzduchu pomocí horkovzdušného fénu.
Deska se prohlédne v UV světle (4.3) a pozice skvrn se vyznačí. Deska se zahřívá 30 minut v sušárně (4.5) při 100 °C, aby se odstranila nadbytečná kyselina octová. Konzervační přísady v chromatogramu se zviditelní Millonovým činidlem (3.10) tak, že válečkem (4.7) namočeným do činidla se TLC deska přejede tak, aby byla rovnoměrně navlhčená.
Poznámka: Skvrny lze rovněž zviditelnit opatrným nanesením kapky Millonova činidla na každou skvrnu označenou pod UV světlem.
Estery kyseliny 4-hydroxybenzoové se projeví jako červené skvrny, 2-fenoxyethanol a 1-fenoxypropan-2-ol jako žluté skvrny. Je však třeba dávat pozor na to, že kyselina 4-hydroxybenzoová, která může být přítomná ve vzorcích jako konzervační látka nebo produkt rozkladu parabenů, se sama o sobě projeví jako červená skvrna. Viz 7.3 a 7.4.
6. Kvalitativní stanovení
Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf. Skvrny získané z roztoku vzorku se porovnají se skvrnami získanými z referenčních roztoků, pokud jde o jejich hodnoty Rf, jejich chování v UV světle a barvu po zviditelnění. Učiní se předběžné závěry o identitě konzervantů.
Pokud se zdá, že jsou přítomny parabeny, provede se analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) popsanou v oddílu B. Výsledky chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) se zkombinují, aby se potvrdila přítomnost 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu a parabenů.
7. Poznámky
7.1 Vzhledem k toxicitě Millonova činidla je nejvhodnější aplikovat toto činidlo jedním z popsaných způsobů. Postřik se nedoporučuje.
7.2 Jiné sloučeniny obsahující hydroxylové skupiny mohou rovněž při reakci s Milionovým činidlem dávat zbarvení. Tabulka barev a hodnot Rf získaných pro řadu konzervantů použitím chromatografie na tenké vrstvě je uvedena v práci N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi a A. Schouten (1987): Determination of preservatives in cosmetic products I: Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatography 410, 395-411).
7.3 Hodnoty Rf uvedené v následující tabulce slouží jako ukazatele hodnot, které lze získat:
| Sloučenina | hRf | Barva |
| Kyselina 4-hydroxybenzoová | 11 | červená |
| Methylparaben | 12 | červená |
| Ethylparaben | 17 | červená |
| Propylparaben | 21 | červená |
| Butylparaben | 26 | červená |
| Benzylparaben | 16 | červená |
| 2-fenoxyethanol | 29 | žlutá |
| 1-fenoxypropan-2-ol | 50 | žlutá |
7.4 V případě kyseliny 4-hydroxybenzoové a methylparabenu a ani v případě benzylparabenu a ethylparabenu nedochází k oddělení. Kvalitativní stanovení těchto sloučenin by mělo být potvrzeno metodou HPLC popsanou v oddílu B a porovnáním retenčních časů vzorku s retenčními časy standardů.