38. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ 2-FENOXYETHANOLU, 1-FENOXYPROPAN-2-OLU, METHYL-, ETHYL-, PROPYL-, BUTYL- A BENZYL-4-HYDROXYBENZOÁTU V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH
A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
1. Rozsah a oblast použití
V této metodě je specifikován postup chromatografie na tenké vrstvě, který v kombinaci s metodou kvantitativního stanovení, popsanou v oddílu B, umožní identifikaci 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.
2. Princip
Konzervační přísady se extrahují z okyselených vzorků kosmetických prostředků acetonem. Po filtraci se acetonový roztok smíchá s vodou a mastné kyseliny se v alkalickém prostředí vysrážejí jako vápenaté soli. Alkalická směs aceton/voda je extrahována diethyletherem, čímž se odstraní lipofilní látky. Po okyselení se konzervační přísady extrahují diethyletherem. Alikvotní část diethyletherového extraktu se nanese na desku pokrytou tenkou vrstvou silikagelu. Po vyvíjení se získaný chromatogram pozoruje v UV světle a zviditelní se za použití Millonova činidla.
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
3.1 Všeobecně
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.
3.2 Aceton
3.3 Diethylether
3.4 n-Pentan
3.5 Methanol
3.6 Kyselina octová, ledová
3.7 Roztok kyseliny chlorovodíkové, 4 mol/l
3.8 Roztok hydroxidu draselného, 4 mol/l
3.9 Chlorid vápenatý dihydrát (CaCl2·2H2O)
3.10 Detekční činidlo: Millonovo činidlo
Millonovo činidlo (dusičnan rtuťnatý) je komerčně dostupný roztok (Fluka 69820).
3.11 2-Fenoxyethanol
3.12 1-Fenoxy-propan-2-ol
3.13 Methyl-4-hydroxybenzoát (methylparaben)
3.14 Ethyl-4-hydroxybenzoát (ethylparaben)
3.15 n-Propyl-4-hydroxybenzoát (propylparaben)
3.16 n-Butyl-4-hydroxybenzoát (butylparaben)
3.17 Benzyl-4-hydroxybenzoát (benzylparaben)
3.18 Standardní roztoky
Připraví se 0,1% (m/V) roztoky každé z referenčních látek 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 a 3.17 v methanolu.
3.19 Mobilní fáze
Smíchá se 88 dílů n-pentanu (3.4) s 12 díly ledové kyseliny octové (3.6).
4 Přístroje a pomůcky
Běžné laboratorní vybavení a
4.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C
4.2 Vyvíjecí komora (nevyložená filtračním papírem)
4.3 Zdroj ultrafialového světla, 254 nm
4.4 Hotové desky 20 cm x 20 cm se sorbční vrstvou: silikagel 60F254 (fluorescenční indikátor), tloušťka vrstvy: 0,25 mm, s koncentrační zónou 25 x 200 mm (Merck No 11798, Darmstadt, nebo ekvivalentní)
4.5 Sušárna nastavitelná na teplotu až do 105 °C
4.6 Horkovzdušný fén
4.7 Vlněný malířský váleček o délce přibližně 10 cm, vnější průměr přibližně 3,5 cm. Vlněná vrstva by měla být 2 až 3 mm silná. Podle potřeby se vlna zastřihne.
Viz poznámka v bodě 5.2.
4.8 Erlenmeyerovy baňky na 50 a 200 ml, se zábrusovou zátkou
4.9 Elektrická topná deska s termostatem. Nastavení teploty: asi 80 °C. Topná deska se pokryje hliníkovou deskou o velikosti 20 cm x 20 cm a tloušťce asi 6 mm, čímž se dosáhne rovnoměrného rozložení tepla.
5. Postup
5.1 Příprava vzorku
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (4.8.) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.7) a 40 ml acetonu.
V případě silně zásaditých kosmetických přípravků, jako je toaletní mýdlo, se přidá 20 kapek roztoku kyseliny chlorovodíkové. Baňka se uzavře, směs se zlehka zahřeje na asi 60 °C, aby se usnadnila extrakce konzervačních látek do acetonové fáze, a 1 minutu se silně třepe.
Indikátorovým papírkem se změří pH roztoku a upraví se na hodnotu ≤3 roztokem kyseliny chlorovodíkové. Znovu se 1 minutu silně třepe.
Roztok se ochladí na laboratorní teplotu a zfiltruje se přes filtrační papír do Erlenmeyerovy baňky. 20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 60 ml vody a promíchá. Hodnota pH směsi se upraví hydroxidem draselným (3.8.) přibližně na 10 za použití indikátorového papírku.
Přidá se 1 g chloridu vápenatého dihydrátu (3.9) a silně se protřepe.
Roztok se zfiltruje přes filtrační papír do dělicí nálevky na 250 ml, která obsahuje 75 ml diethyletheru, a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a vodná fáze se vypustí do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml. Hodnota pH roztoku se upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové na přibližně 2 za použití indikátorového papírku. Poté se přidá 10 ml diethyletheru a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a asi 2 ml fáze diethyletheru se převede do vzorkovací lahvičky na 5 ml.
5.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)
TLC deska se umístí na zahřátou hliníkovou desku (4.9.) Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky se nanese 10 μl každého z referenčních roztoků a 100 μl roztoku vzorku (vzorků) (5.1).
Podle potřeby lze podpořit odpaření rozpouštědla proudem vzduchu. TLC deska se odstraní z topné desky a nechá se vychladnout na laboratorní teplotu. Vyvíjecí komora (4.2) se naplní 100 ml mobilní fází (3.19).
TLC deska se ihned vloží do nenasycené komory a vyvíjí se při laboratorní teplotě, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí asi 15 cm od základní linie. Deska se z vyvíjecí komory vyjme a vysuší v proudu horkého vzduchu pomocí horkovzdušného fénu.
Deska se prohlédne v UV světle (4.3) a pozice skvrn se vyznačí. Deska se zahřívá 30 minut v sušárně (4.5) při 100 °C, aby se odstranila nadbytečná kyselina octová. Konzervační přísady v chromatogramu se zviditelní Millonovým činidlem (3.10) tak, že válečkem (4.7) namočeným do činidla se TLC deska přejede tak, aby byla rovnoměrně navlhčená.
Poznámka: Skvrny lze rovněž zviditelnit opatrným nanesením kapky Millonova činidla na každou skvrnu označenou pod UV světlem.
Estery kyseliny 4-hydroxybenzoové se projeví jako červené skvrny, 2-fenoxyethanol a 1-fenoxypropan-2-ol jako žluté skvrny. Je však třeba dávat pozor na to, že kyselina 4-hydroxybenzoová, která může být přítomná ve vzorcích jako konzervační látka nebo produkt rozkladu parabenů, se sama o sobě projeví jako červená skvrna. Viz 7.3 a 7.4.
6. Kvalitativní stanovení
Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf. Skvrny získané z roztoku vzorku se porovnají se skvrnami získanými z referenčních roztoků, pokud jde o jejich hodnoty Rf, jejich chování v UV světle a barvu po zviditelnění. Učiní se předběžné závěry o identitě konzervantů.
Pokud se zdá, že jsou přítomny parabeny, provede se analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) popsanou v oddílu B. Výsledky chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) se zkombinují, aby se potvrdila přítomnost 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu a parabenů.
7. Poznámky
7.1 Vzhledem k toxicitě Millonova činidla je nejvhodnější aplikovat toto činidlo jedním z popsaných způsobů. Postřik se nedoporučuje.
7.2 Jiné sloučeniny obsahující hydroxylové skupiny mohou rovněž při reakci s Milionovým činidlem dávat zbarvení. Tabulka barev a hodnot Rf získaných pro řadu konzervantů použitím chromatografie na tenké vrstvě je uvedena v práci N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi a A. Schouten (1987): Determination of preservatives in cosmetic products I: Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatography 410, 395-411).
7.3 Hodnoty Rf uvedené v následující tabulce slouží jako ukazatele hodnot, které lze získat:
| Sloučenina | hRf | Barva |
| Kyselina 4-hydroxybenzoová | 11 | červená |
| Methylparaben | 12 | červená |
| Ethylparaben | 17 | červená |
| Propylparaben | 21 | červená |
| Butylparaben | 26 | červená |
| Benzylparaben | 16 | červená |
| 2-fenoxyethanol | 29 | žlutá |
| 1-fenoxypropan-2-ol | 50 | žlutá |
7.4 V případě kyseliny 4-hydroxybenzoové a methylparabenu a ani v případě benzylparabenu a ethylparabenu nedochází k oddělení. Kvalitativní stanovení těchto sloučenin by mělo být potvrzeno metodou HPLC popsanou v oddílu B a porovnáním retenčních časů vzorku s retenčními časy standardů.
B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
1. Rozsah a oblast použití
V této metodě je specifikován postup pro stanovení 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.
2. Definice
Množství konzervačních přísad stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.
3. Princip
Vzorek se okyselí přidáním kyseliny sírové a poté se suspenduje ve směsi ethanolu a vody. Směs se opatrně zahřeje do rozpuštění tukové fáze, aby se zajistila kvantitativní extrakce, a poté se zfiltruje.
Konzervační látky ve filtrátu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s obrácenou fází za použití isopropyl-4-hydroxybenzoátu jako vnitřního standardu.
4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
4.1 Všeobecně
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.
4.2 Ethanol, absolutní
4.3 2-Fenoxyethanol
4.4 1-Fenoxypropan-2-ol
4.5 Methyl-4-hydroxybenzoát (methylparaben)
4.6 Ethyl-4-hydroxybenzoát (ethylparaben)
4.7 n-Propyl-4-hydroxybenzoát (propylparaben)
4.8 Isopropyl-4-hydroxybenzoát (isopropylparaben)
4.9 n-Butyl-4-hydroxybenzoát (butylparaben)
4.10 Benzyl-4-hydroxybenzoát (benzylparaben)
4.11 Tetrahydrofuran
4.12 Methanol
4.13 Acetonitril
4.14 Roztok kyseliny sírové, 2 mol/l
4.15 Směs ethanol/voda
Smíchá se devět dílů ethanolu (4.2) a jeden díl vody.
4.16 Roztok vnitřního standardu
Naváží se přibližně 0,25 g isopropylparabenu (4.8) přesně, převede se do odměrné baňky na 500 ml, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda (4.15).
4.17 Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril
Smíchá se 5 dílů tetrahydrofuranu, 60 dílů vody, 10 dílů methanolu a 25 dílů acetonitrilu.
4.18 Zásobní roztok standardů
Do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží přibližně 0,2 g 2-fenoxyethanolu, 0,2 g 1-fenoxypropan-2-olu, 0,05 g methylparabenu, 0,05 g ethylparabenu, 0,05 g propylparabenu, 0,05 g butylparabenu a 0,025 g benzylparabenu, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda.
Roztok se uchovává v ledničce a je stabilní 1 týden.
4.19 Standardní roztoky konzervačních přísad
Do odměrných baněk na 50 ml se ze zásobního roztoku (4.18) převede 20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml a 1,00 ml. Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (4.16) a 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a doplní se na objem směsí ethanol/voda. Tyto roztoky se připravují vždy čerstvé.
5. Přístroje a pomůcky
Obvyklé laboratorní vybavení a
5.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C ± 1 °C
5.2 HPLC chromatograf s UV detektorem, vlnová délka 280 nm
5.3 Analytická kolona:
Nerezová ocel, délka 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, (nebo délka 12,5 cm a vnitřní průměr 4,6 mm), naplněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentním (viz 10.1).
5.4 Erlenmeyerovy baňky na 100 ml, se zábrusovou zátkou
5.5 Varné kamínky, karborundum, velikost 2 až 4 mm, nebo ekvivalentní
6. Postup
6.1 Příprava vzorku
6.1.1 Příprava vzorku bez přidání vnitřního standardu
Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se odváží asi 1,0 g vzorku přesně. Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 50,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5), baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.
Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do ledničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.
Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky. Extrakty se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.
6.1.2 Příprava vzorků včetně přidání vnitřního standardu
Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se s přesností na tři desetinná místa odváží 1,0 g ± 0,1 g vzorku.
Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5) a přesně 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.
Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do chladničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.
Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky (zkušební roztok). Extrakt se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.
6.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)
6.2.1 Chromatografické podmínky
— Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril (4.17)
— Průtoková rychlost: 1,5 ml/min
— Detekční vlnová délka: 280 nm
6.2.2 Kalibrace
Nastříkne se 10 μl každého ze standardních roztoků konzervantů (4.19). Ze získaných chromatogramů se stanoví poměr výšek píků standardních roztoků konzervantů k píku vnitřního standardu. Pro každý konzervant se sestrojí křivka závislosti těchto poměrů na koncentraci standardních roztoků.
6.2.3 Stanovení
Do chromatogafu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku bez vnitřního standardu (6.1.1) a zaznamená se chromatogram.
Nastříkne se 10 μl jednoho ze standardních roztoků konzervantů (4.19) a zaznamená se chromatogram. Získané chromatogramy se porovnají.
Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (6.1.1) přítomen pík s přibližně stejným retenčním časem, jako je retenční čas píku isopropylparabenu (doporučený vnitřní standard), pokračuje se nastříknutím 10 μl roztoku vzorku s vnitřním standardem (6.1.2). Chromatogram se zaznamená a změří se výšky píků.
Je-li v chromatogramu roztoku vzorku rušivý pík s retenčním časem přibližně stejným jako retenční čas isopropylparabenu, měl by být vybrán jiný vnitřní standard.
Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu vzorku přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.
Vypočítají se poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.
Je třeba ověřit, že kalibrační křivka použitého standardu je lineární.
Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:
— separace píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice separace píků je uveden na obrázku 16.)
Obrázek 16: Separace píků
Není-li požadované separace dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona, nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn.
— faktor asymetrie (As) všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 17.) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.
17: Faktor asymetrie píku
— Základna by měla být stabilní.
7. Výpočet
Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použije kalibrační křivka (6.2.2) a hodnoty poměrů výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.
Obsah (wi) 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v hmotnostních procentech (% m/m) se vypočte pomocí vzorce:
kde
| bi = | koncentrace konzervantu i ve zkušebním roztoku (μg/ml) odečtená z kalibrační křivky, a |
| a = | hmotnost zkušebního vzorku (g). |
8. Opakovatelnost
Viz poznámka v bodě 10.5.
9. Reprodukovatelnost
Viz poznámka v bodě 10.5.
10. Poznámky
10.1 Stacionární fáze
Retenční chování rozpouštěných látek při stanoveních HPLC výrazně závisí na typu, značce a historii stacionární fáze. Zda lze kolonu použít pro oddělení vyšetřovaných konzervantů, lze usoudit z výsledků získaných pro standardní roztoky (viz poznámky v bodě 6.2.3). Kromě navrhovaného materiálu náplně kolony byly shledány vhodnými také materiály Hypersil ODS a Zorbax ODS.
Za účelem dosažení požadovaného oddělení lze popřípadě optimalizovat složení mobilní fáze.
10.2 Detekční vlnová délka
Testování robustnosti popisované metody ukázalo, že nepatrná změna detekční vlnové délky může mít významný vliv na výsledky stanovení.
Tento parametr musí být proto během analýzy pečlivě kontrolován.
10.3 Rušivé vlivy
Za podmínek popsaných v této metodě je eluováno mnoho dalších sloučenin, jako jsou konzervanty a kosmetické přísady. Retenční časy velkého množství konzervantů uvedených v příloze VI směrnice Rady týkající se kosmetických prostředků jsou uvedeny v práci N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schoulen, (1989). Determination of preservatives in cosmetic products II. High-performance liquid chromatographic identification (J, Chromatography 469, 317-398).
10.4 Pro ochranu analytické kolony lze použít vhodnou předkolonu.
10.5 Metoda byla zkoušena při okružním pokusu, na němž se podílelo devět laboratoří. Byly analyzovány tři vzorky. V následující tabulce jsou pro každý ze tři vzorků uvedeny střední hodnoty v % m/m (m), opakovatelnosti (r) a reprodukovatelnosti (R) zjištěné pro analyty, které byly ve vzorcích obsaženy:
| Vzorek | 2-Fenoxy-ethanol | 1-Fenoxy-propan-2-ol | Methylparaben | Ethylparaben | Propylparaben | Butylparaben | Benzylparaben | |
| Vitaminový krém | m | 1,124 | 0,250 | 0,0628 | 0,031 | 0,0906 | ||
| r | 0,016 | 0,018 | 0,0035 | 0,0280 | 0,0044 | |||
| R | 0,176 | 0,030 | 0,0068 | 0,0111 | 0,0034 | |||
| Základní pleťový krém | m | 1,196 | 0,266 | 0,076 | ||||
| r | 0,040 | 0,003 | 0,002 | |||||
| R | 0,147 | 0,022 | 0,004 | |||||
| Masážní krém | m | 0,806 | 0,180 | 0,148 | 0,152 | |||
| r | 0,067 | 0,034 | 0,013 | 0,015 | ||||
| R | 0,112 | 0,078 | 0,012 | 0,016 | ||||